酵母双杂交法：全面解析原理、实验步骤与常见问题 酵母双杂交法（Yeast Two-Hybrid）是一种重要的研究蛋白质相互作用的技术。其核心原理在于利用酵母细胞中的GAL4蛋白的DNA结合域（BD）和激活域（AD）与目标蛋白X和Y进行融合，通过检测报告基因的表达来分析蛋白质间的相互作用。在实施酵母双杂交法时，需要遵循一系列...
转化与筛选:将构建好的载体转化大肠杆菌,筛选阳性克隆并进行测序鉴定。 共转酵母细胞 🌱 将目的AD载体与BD载体共同转化到酵母细胞中。 二缺培养基培养:将转化后的酵母细胞均匀涂布在二缺板(SD/-Leu/-Trp)上培养。 影印三缺和四缺板:将二缺平板上生长的酵母单克隆影印至三缺板(SD/-His/-Leu/Trp)和四缺板...
酵母双杂交系统(Yeast two hybrid,Y2H)是探索蛋白质相互作用的强大工具。🔍 通过融合GAL4的DNA结合和激活结构域,我们可以检测两种蛋白质是否相互作用。💪📌 实验步骤: 1️⃣ 酵母感受态细胞制备: - 从-80℃取出酵母菌株,在YPDA平板上划线,培养4-7天。 - 挑取单菌落至3mL YPDA液体培养液,培养8小时至OD值...
接下来，我们将详细介绍酵母双杂交实验的步骤。首先，需要制备酵母感受态细胞。这一过程包括将酵母菌株在YPDA固体培养基上培养，挑取单菌落进行液体培养，然后转移到更大的培养体积中继续培养，直至细胞达到适当的密度。接着，通过离心收集细胞，并用适当的缓冲液重悬，最终得到酵母感受态细胞。在获得酵母感受态细胞后，我们...
酵母双杂交实验的基本步骤包括: 1).目标蛋白的克隆:将目标蛋白的基因分别克隆到DNA-BD和AD表达载体上。 2).酵母转化:通过酵母细胞转化技术将DNA-BD和AD载体导入酵母细胞中。 3).筛选和验证:通过选用特定培养基(如SD/-His)进行筛选,获得阳性克隆,并进一步验证蛋白质相互作用的可靠性。
1)用接种环将冻存在-70 C°的酵母Y190贮备备液划于YPD琼脂培养平板上,在30 C°培养,直到菌落直径达到2mm,约需3-5天,密封平板,4°C保存。 2)正常的Y190菌落由于ade2-101突变而呈粉红色,并且直径>2 mm。挑取3-4个菌落置于不同培养平板上(SD/-Trp,SD/-Leu,,SD/-His,SD/-Ura,YPD),培养 4-6天。
酵母双杂交实验采用Clontech公司的GAL4双杂交系统进行，并利用上海唯地生物技术有限公司提供的Y2H Gold酵母感受态细胞。具体实验步骤如下：（1）首先，对连接pGBKT7（BD）载体的蛋白进行自激活鉴定。将LcWRKY的CDS全长序列通过EcoR I和BamHI酶切位点克隆至pGBKT7载体，构建好的重组质粒通过PEG/LiAC介导转入Y2H Gold...
🍞 酵母双杂交系统是一种强大的分子生物学工具,用于研究蛋白质相互作用。以下是实验的详细步骤:1️⃣ 酵母菌株的保存与表达型验证 在30°C下培养酵母菌株,直到菌落直径达到2mm,约需3-5天。将菌落密封保存于4°C。正常的Y190菌落由于ade2-101突变而呈粉红色,直径>2mm。挑选3-4个菌落分别置于不同培养平板上...
图1.酵母双杂交技术原理(图片来源于网络) 目前酵母双杂交实验采用的系统有 LexA 系统和Gal4 系统两种。在 LexA 系统中,DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白 LexA 构成,转录激活结构域则由一个 88 个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽 B42 构成,它在酵母中可以活化基因的转录;在 Gal4 系统中,BD 和 AD 分别由 Gal...
酵母双杂交系统可进行两个蛋白互作分析,可用一个已知的蛋白因子(在双杂交系统中称为诱饵蛋白)去钓取与其结合的蛋白;也可用进一步验证两个蛋白之间的互作。 酵母双杂交实验细节(酵母双杂交技术步骤) 酵母双杂交实验原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现,许多真核生物的转录激活因...