室温下4,000 rpm离心5 min收集菌体,用无菌IxTE洗菌体后,用新鲜配制的1 xTE/LiAc溶液重悬。 3、酵母感受态细胞的转化 1)制备PEG/LiAc溶液。 2)将各组分在反应管中混勾(BD载体构建产物0.1 μg + AD载体构建产物0.1 μg +鲑精 DNA 0.1 mg)。 3)在反应管中加入酵母感受态细胞100 μl,混匀; 4)加入PEG...
转化与筛选:将构建好的载体转化大肠杆菌,筛选阳性克隆并进行测序鉴定。 共转酵母细胞 🌱 将目的AD载体与BD载体共同转化到酵母细胞中。 二缺培养基培养:将转化后的酵母细胞均匀涂布在二缺板(SD/-Leu/-Trp)上培养。 影印三缺和四缺板:将二缺平板上生长的酵母单克隆影印至三缺板(SD/-His/-Leu/Trp)和四缺板...
酵母双杂交法：全面解析原理、实验步骤与常见问题 酵母双杂交法（Yeast Two-Hybrid）是一种重要的研究蛋白质相互作用的技术。其核心原理在于利用酵母细胞中的GAL4蛋白的DNA结合域（BD）和激活域（AD）与目标蛋白X和Y进行融合，通过检测报告基因的表达来分析蛋白质间的相互作用。在实施酵母双杂交法时，需要遵循一系列...
三、酵母双杂交实验的基本流程1. 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株,用培养基SD/-Ura筛选。2. 同时构建或扩增DNA文库, 5、并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。3. 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X,作为钓饵(bait)。4. 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株,用SD/-His/-Ura筛选;并用固体诱导...
酵母双杂交实验采用Clontech公司的GAL4双杂交系统进行，并利用上海唯地生物技术有限公司提供的Y2H Gold酵母感受态细胞。具体实验步骤如下：（1）首先，对连接pGBKT7（BD）载体的蛋白进行自激活鉴定。将LcWRKY的CDS全长序列通过EcoR I和BamHI酶切位点克隆至pGBKT7载体，构建好的重组质粒通过PEG/LiAC介导转入Y2H Gold...
加入100 μL酵母感受态细胞并轻轻混匀,30℃,200 rpm,培养30分钟(可缩短或取消)。 加入600 μL PEG/LiAC溶液(40% PEG,1×LiAC,1×TE)。轻轻吹打混匀。30℃,200 rpm,培养30-90分钟。 加入70 μL DMSO,轻轻颠倒混匀。 42℃水浴中热激10分钟。冰上放置2分钟。 室温,4000 rpm,离心2分钟。弃上清,加100...
酵母双杂交实验步骤 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点,通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质,其大致步骤为: 1、构建重组Activation Domain(AD)融合的重组质粒(pGADT7载体)以及Binding Domain(BD)融合的重组质粒(pGBKT7载体); ...
下面将介绍酵母双杂交的步骤。 第一步:构建酵母双杂交载体 酵母双杂交载体是用于表达融合蛋白的质粒。一般来说,酵母双杂交载体包括两个部分:DNA结合域(DBD)和激活域(AD)。DBD和AD分别与目标蛋白的DNA结合域和激活域融合,从而形成融合蛋白。常用的酵母双杂交载体有pGBKT7和pGADT7。 第二步:构建酵母双杂交菌株 ...
接下来，我们将详细介绍酵母双杂交实验的步骤。首先，需要制备酵母感受态细胞。这一过程包括将酵母菌株在YPDA固体培养基上培养，挑取单菌落进行液体培养，然后转移到更大的培养体积中继续培养，直至细胞达到适当的密度。接着，通过离心收集细胞，并用适当的缓冲液重悬，最终得到酵母感受态细胞。在获得酵母感受态细胞后，我们...