室温下4,000 rpm离心5 min收集菌体,用无菌IxTE洗菌体后,用新鲜配制的1 xTE/LiAc溶液重悬。 3、酵母感受态细胞的转化 1)制备PEG/LiAc溶液。 2)将各组分在反应管中混勾(BD载体构建产物0.1 μg + AD载体构建产物0.1 μg +鲑精 DNA 0.1 mg)。 3)在反应管中加入酵母感受态细胞100 μl,混匀; 4)加入PEG...
转化与筛选:将构建好的载体转化大肠杆菌,筛选阳性克隆并进行测序鉴定。 共转酵母细胞 🌱 将目的AD载体与BD载体共同转化到酵母细胞中。 二缺培养基培养:将转化后的酵母细胞均匀涂布在二缺板(SD/-Leu/-Trp)上培养。 影印三缺和四缺板:将二缺平板上生长的酵母单克隆影印至三缺板(SD/-His/-Leu/Trp)和四缺板...
酵母双杂交法：全面解析原理、实验步骤与常见问题 酵母双杂交法（Yeast Two-Hybrid）是一种重要的研究蛋白质相互作用的技术。其核心原理在于利用酵母细胞中的GAL4蛋白的DNA结合域（BD）和激活域（AD）与目标蛋白X和Y进行融合，通过检测报告基因的表达来分析蛋白质间的相互作用。在实施酵母双杂交法时，需要遵循一系列...
为了进一步确认这一发现，我们将MabZIP74和MaMAPK11-3分别与DBD或AD载体融合，并进行酵母双杂实验。结果显示，在二缺培养基（SD/-Leu/-Trp）上，所有组合均能生长出白色酵母菌落，这证明DBD和AD的重组载体已成功转入酵母细胞中。随后，我们将这些酵母转移到四缺培养基上进行培养，发现DBD-MabZIP74与AD-MaMAPK11...
加入100 μL酵母感受态细胞并轻轻混匀,30℃,200 rpm,培养30分钟(可缩短或取消)。 加入600 μL PEG/LiAC溶液(40% PEG,1×LiAC,1×TE)。轻轻吹打混匀。30℃,200 rpm,培养30-90分钟。 加入70 μL DMSO,轻轻颠倒混匀。 42℃水浴中热激10分钟。冰上放置2分钟。 室温,4000 rpm,离心2分钟。弃上清,加100...
接下来，我们将详细介绍酵母双杂交实验的步骤。首先，需要制备酵母感受态细胞。这一过程包括将酵母菌株在YPDA固体培养基上培养，挑取单菌落进行液体培养，然后转移到更大的培养体积中继续培养，直至细胞达到适当的密度。接着，通过离心收集细胞，并用适当的缓冲液重悬，最终得到酵母感受态细胞。在获得酵母感受态细胞后，我们...
三、酵母双杂交实验的基本流程1. 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株,用培养基SD/-Ura筛选。2. 同时构建或扩增DNA文库, 5、并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。3. 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X,作为钓饵(bait)。4. 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株,用SD/-His/-Ura筛选;并用固体诱导...
下面将介绍酵母双杂交的步骤。 第一步:构建酵母双杂交载体 酵母双杂交载体是用于表达融合蛋白的质粒。一般来说,酵母双杂交载体包括两个部分:DNA结合域(DBD)和激活域(AD)。DBD和AD分别与目标蛋白的DNA结合域和激活域融合,从而形成融合蛋白。常用的酵母双杂交载体有pGBKT7和pGADT7。 第二步:构建酵母双杂交菌株 ...
酵母双杂交四缺实验步骤 一、酵母双杂交四缺实验的原理简单说说 酵母双杂交四缺实验呢,就是一种很神奇的实验啦。它主要是用来研究蛋白质之间相互作用的。你想啊,在细胞这个小小的世界里,蛋白质们就像一个个小工人,它们之间的相互配合可重要了。这个实验就像是给这些小工人安排了一个特殊的考场,看看哪些蛋白质之间...