酵母双杂交法：全面解析原理、实验步骤与常见问题 酵母双杂交法（Yeast Two-Hybrid）是一种重要的研究蛋白质相互作用的技术。其核心原理在于利用酵母细胞中的GAL4蛋白的DNA结合域（BD）和激活域（AD）与目标蛋白X和Y进行融合，通过检测报告基因的表达来分析蛋白质间的相互作用。在实施酵母双杂交法时，需要遵循一
室温下4,000 rpm离心5 min收集菌体,用无菌IxTE洗菌体后,用新鲜配制的1 xTE/LiAc溶液重悬。 3、酵母感受态细胞的转化 1)制备PEG/LiAc溶液。 2)将各组分在反应管中混勾(BD载体构建产物0.1 μg + AD载体构建产物0.1 μg +鲑精 DNA 0.1 mg)。 3)在反应管中加入酵母感受态细胞100 μl,混匀; 4)加入PEG...
10. 准备转化的质粒:将1 μg质粒DNA(共转化时,两种质粒各为1 μg)及2 μL 10 mg/mL的变性鲑精DNA加入2 mL离心管中,充分混匀,总体积不应超过10 μL。 11. 加入100 μL酵母感受态细胞并轻轻混匀,30℃,200 rpm,培养30 min(可缩短或取消)。 12. 加入600 μL PEG/LiAC溶液(40% PEG,1×LiAC,1×...
三、酵母双杂交实验的基本流程1. 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株,用培养基SD/-Ura筛选。2. 同时构建或扩增DNA文库, 5、并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。3. 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X,作为钓饵(bait)。4. 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株,用SD/-His/-Ura筛选;并用固体诱导...
酵母双杂交实验采用Clontech公司的GAL4双杂交系统进行，并利用上海唯地生物技术有限公司提供的Y2H Gold酵母感受态细胞。具体实验步骤如下：（1）首先，对连接pGBKT7（BD）载体的蛋白进行自激活鉴定。将LcWRKY的CDS全长序列通过EcoR I和BamHI酶切位点克隆至pGBKT7载体，构建好的重组质粒通过PEG/LiAC介导转入Y2H Gold...
加入100 μL酵母感受态细胞并轻轻混匀,30℃,200 rpm,培养30分钟(可缩短或取消)。 加入600 μL PEG/LiAC溶液(40% PEG,1×LiAC,1×TE)。轻轻吹打混匀。30℃,200 rpm,培养30-90分钟。 加入70 μL DMSO,轻轻颠倒混匀。 42℃水浴中热激10分钟。冰上放置2分钟。 室温,4000 rpm,离心2分钟。弃上清,加100...
GAL4酵母双杂交实验步骤 1. 挑AH109酵母单菌落，接种到4mlYPD 培养基中（用50ml 离心管），30℃，250rpm ，8-12h ；2. 接种200ul 菌液到50mlYPD 培养基中（用250ml 摇瓶），16-20h ；3. 1200-1500g 离心5min ，YPD 重悬，全部接种到100ml 新鲜的YPD 培养基，3-5h ；4. 1200-1500g 离心5min ，...
酵母双杂交实验步骤 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点,通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质,其大致步骤为: 1、构建重组Activation Domain(AD)融合的重组质粒(pGADT7载体)以及Binding Domain(BD)融合的重组质粒(pGBKT7载体); ...
1.1 选择适宜的酵母菌株,如AH109、Y2HGold等,并进行预培养。 1.2 构建膜体系酵母菌株,将pGBKT7-Mem构建到酵母菌株中,该质粒含有酵母菌体指示蛋白gene4和bait构建位点。 1.3 进行生长速度测试,筛选出正常生长菌株作为后续实验的基础材料。 二、膜蛋白靶基因的克隆 2.1 筛选目标膜蛋白的cDNA序列,进行...