westernblot步骤: (一)蛋白质样品获得:细菌诱导表达后,可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞,真核细胞加匀浆缓冲液,机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃,13,000g离心15min。取上清液作为样品。 (二)电泳:制备电泳凝胶,进行SDS-PAGE。 (三)转移:(半干式转移) 1、电泳结束后将胶条割至合适大小,用转膜缓冲液平...
蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)是将蛋白质经电泳分离后转移到膜上,然后利用抗体进行检测的技术。完整的WB流程,如下图所示,包含样本制备、SDS-PAGE、转膜、抗体结合、蛋白检测等5个大步骤。 样品制备 1、蛋白提取 1)融解RIPA裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1 mM。
Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测.对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测. 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗....
WesternBlot操作步骤 1.样品处理: -收集样品:从细胞培养物中收集细胞或从组织中收集组织样品。 -破碎细胞:使用合适的细胞破碎缓冲液将细胞破碎并释放蛋白质。 -甲醇沉淀:向破碎细胞中加入冷甲醇,以沉淀蛋白质,并将混合液冷冻在-20℃或-80℃下,使形成沉淀物。 -洗涤:使用冷丙酮洗涤蛋白质沉淀物,去除甲醇等杂质。
蛋白质免疫印迹法即Western Blot。 它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法,基本原理是经过 PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品,转移到固相载体例如硝酸纤维素薄膜(NC膜)或PVDF膜上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
这一步是将蛋白质转移至固相载体上,常用固相材料有NC膜、PVDF膜等。常用湿法或半干法转模。这一实验步骤中要戴一次性PE手套,防止手上的蛋白污染膜。 1、湿转 图2 湿法转印堆积层组装示意图 (1)转印缓冲液:Tris 5.8g、甘氨酸2.9g、10%(v/v)甲醇、SDS 0.37g、甲醇200ml使用蒸馏水定容至1L,pH 8.3,4℃保存...
步骤:①将RIPA和PMSF按比例混匀,加入到装有组织粉末的EP管中,一般加入300~500μl左右(浓度尽量高点)。 ②盖好盖子,在冰上裂解30~40min. ③到时间后于4℃,12000rpm离心10min,取上清液转移到新的离心管中,于-20℃保存。 注意:1.裂解液加入后用手指弹一下混匀,当加入量很少时,成粘稠状,有必要时应用枪头...
最开始做印迹的是一个叫Southern的科学家,但印迹的对象是DNA链,他把这种技术称为Southern blot,后来出现了两个过程相似,但是对象不同的印迹方法,一个针对RNA,一个对蛋白质,人们分别把这两种技术的称为Northern和Western。 WB实验操作流程 一、蛋白质的样品制备 ...
1.准备一张适合大小的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)以及滤纸6片。将胶浸泡于转移缓冲液中10min(如检测小分子蛋白,即可免去这一步骤,因小分子蛋白容易扩散出胶)。 2.在使用PVDF膜之前需进行活化:PVDF膜需在纯甲醇中浸泡3-5s,再于盆里加入转移缓冲液,并把转膜用的架子、玻璃棒、滤纸、两块海绵和经过甲醇活化的PVDF活化...