吸显影液滴在膜上,确保显影液浸润到了膜所有地方;3、image Lab曝光步骤:膜放置皿中(小口径玻璃皿中)—打开仪器(image lab),膜放入机器—选择印迹—colorimetic—自动曝光—拍白光圈4、曝光拍照(CHEMI)—选择“放置凝胶”——设置曝光时间(自动or手动)—凝胶成像—保存注意:一抗原液(1:1000)稀释,若显影条带...
首先,我们来回顾下整个 WB 流程:蛋白样本制备 → 电泳 → 转膜 → 封闭 →孵育一抗→ 孵育二抗 → 显影 → 分析。 图1. Western blot 的流程图[1]。 1 蛋白样本制备 1.1 总蛋白提取 (1) 准备溶液 室温融解蛋白裂解液RIPA,加入蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(10X),使最终浓度为 1X,混匀,立即放置在冰上。
(2) 倾斜垂直槽制胶架子装入垂直槽制胶固定架,注意为防止胶片变形漏液体,不要过分用力下压,并确保卡好。(3) 按照每块 5 mL 配制分离胶(1 mm 厚度),轻轻混匀后立即铺板;(SDS-PAGE 凝胶配方详见“怎么做 Western blot? 看这一篇就够了!”)(4) 铺板后用异丙醇将分离胶液面压平;(5) 凝固 40 min 后,...
图 1. Western blot 的流程图[2]万丈高楼第一步：准备材料 要想实验节奏稳，准备工作那可要妥妥的——缓冲液配制。小 M 在此总结了 WB 实验中所涉及的各类缓冲液的配方，拿走拿走别客气～滑动查看更多页面 表 1. Western blotting 各类缓冲液配方 默默问一句，看完这些配方，您倦了吗？疯狂计算，反复称量，...
一、原理蛋白质免疫印迹法即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法,基本原理是经过 PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品,转移到固相载体例如硝酸纤维素薄膜(NC膜)或PVDF膜上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳
蛋白质免疫印迹法即Western Blot。 它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法,基本原理是经过 PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品,转移到固相载体例如硝酸纤维素薄膜(NC膜)或PVDF膜上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
图1.Western blot实验流程图 2.1 蛋白质的提取 成功提取出高质量的蛋白，WB实验便成功了一半。接下来，我们先看看蛋白质如何提取。由于质粒或者病毒载体携带的外源基因转染细胞后36-48小时左右达到表达高峰，因此建议在这个时间收集并裂解细胞。具体步骤如下：① 裂解细胞：裂解过程中一般会用到RIPA裂解液（其原理是...
Western blot实验步骤可以分为蛋白样品的准备(包括蛋白质的提取和定量)和SDS-PAGE电泳(包括电泳、转膜、封闭、孵育一抗、孵育二抗和显影)这两大块内容。接下来我们看下Western blot实验的具体步骤。 图1.Western blot实验流程图 2.1 蛋白质的提取 成功提取出高质量的蛋白,WB实验便成功了一半。接下来,我们先看看蛋白...
二、流程图: (一)蛋白上清液提取: a、准备工作:分装需要体积的蛋白裂解液(IP/RIPA),再分别加蛋白酶抑制剂(蛋白裂解液:PMSF 体积比为100:1),磷酸化蛋白酶抑制剂(蛋白裂解液:磷酸化蛋白酶抑制剂体积比为100:2)于蛋白裂解液中,加入Aprotinin 蛋白酶抑制剂,蛋白裂解液:Aprotinin(500×)体积比为 100:0.2; ...
图1.Western blot实验流程图 2.1 蛋白质的提取 成功提取出高质量的蛋白,WB实验便成功了一半。接下来,我们先看看蛋白质如何提取。由于质粒或者病毒载体携带的外源基因转染细胞后36-48小时左右达到表达高峰,因此建议在这个时间收集并裂解细胞。具体步骤如下: