Western Blot的第一步为蛋白提取,提取方法根据检测目标的类型可分为总蛋白提取、核蛋白提取、膜蛋白提取,对于大多数应用进行总蛋白提取即可。 总蛋白提取所需的试剂为:裂解液、蛋白酶抑制剂。 ▲裂解液 裂解液的成分主要有Triton X-100、NP-40、SDS等,不同裂解强度和实验应用范围的裂解液成分有所差别,裂解液的原...
WB,是Western blotting的缩写,即蛋白质印迹法,又称免疫印迹(immunoblotting),也就通过电泳技术分离不同组分,再采用印迹技术将蛋白质转移(“印”)到特定的膜上,再利用抗原-抗体的特异性结合原理,用抗体作为探针去实现检测复杂样品中的靶标蛋白的方法,这项技术也可以用来检测不同时期蛋白表达的水平以及蛋白相互作用等...
蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)是将蛋白质经电泳分离后转移到膜上,然后利用抗体进行检测的技术。完整的WB流程,如下图所示,包含样本制备、SDS-PAGE、转膜、抗体结合、蛋白检测等5个大步骤。 样品制备 1、蛋白提取 1)融解RIPA裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1 mM。
将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60 V转移2 h或40 V转移3 h（可能会有比较大差别，我们实验室一般200 mA（约70 V）转膜15 min就可以了，20 min有的转过了，有次转了1小时，全都投过去了）。转完后将膜用1×...
WB(Western Blot,蛋白免疫印迹)是一种常规的蛋白分析技术,常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。 WB实验的基本核心理念是抗原抗体的特异性反应,通过变性胶 SDS-PAGE 将不同分子量的蛋白质分离开,然后转移到固相载体 PVDF 膜上,再用脱脂牛奶作为封闭液进行封闭和一抗稀释液进行稀释。待目的蛋白和抗体...
一、转膜 这一步是将蛋白质转移至固相载体上，常用固相材料有NC膜、PVDF膜等。常用湿法或半干法转模。这一实验步骤中要戴一次性PE手套，防止手上的蛋白污染膜。1、湿转 （1）转印缓冲液：Tris 5.8g、甘氨酸2.9g、10%（v/v）甲醇、SDS 0.37g、甲醇200ml使用蒸馏水定容至1L，pH 8.3，4℃保存。（2）...
一、实验步骤 蛋白样品制备:从细胞或组织中提取蛋白质样品,常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。 蛋白定量:使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量,以便后续的Western blot分析。 凝胶电泳:将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离,根据蛋白质的大小和电荷进行分离。 转膜:将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素...
蛋白免疫印迹（Western Blot）Buffer的准备 1）准备甲醇和ddH2O；2）配制1× PBST：500 mL 1× PBS+0.25 mL tween 20；3）配制5%的BSA封闭液：2.5 g的BSA溶解到50 mL 1x PBST中；4）配制一抗，二抗：用5%的BSA封闭液按说明书推荐比例稀释(一般新买的培养基可以进一步稀释使用)；5）10× running buffer...