④上样：用微量进样器吸取适量样品液，按照②中的设置将样品液缓缓加入凝胶板内地凹口部位(样品点入处)，再缓慢抽出枪头，以免蛋白样品飘出凝胶孔，造成实验误差。每个孔的蛋白上样量在10-50ug为宜，体积控制在20ul左右。尽量保持每个泳道的蛋白量一样，体积尽量一致，方便后续观察蛋白的表达量。⑤电泳：随后用...
对于10孔梳子1mm厚度凝胶,每孔上样量(蛋白质混合物)约30ug。二:聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(电泳) 将电极插头与电源上对应的电极连接,电流应流向正极; 将电压调至80V,预计20min后待染料迁移至分离胶时,将电压调至100V,60min待溴酚蓝到达凝胶底部时,停止电泳,关闭电源,从电源上拔掉电极插头,从平板中...
(1)根据BCA测定蛋白浓度决定待测样品上样体积,通常每孔上样蛋白含量为50μg。10孔梳子加样孔的最大限度可加30ul样品,若上样蛋白50μg的体积超过25μl,则可减少蛋白上样总量为40μg或45μg。 (2)根据实验目的,合理安排检测样品的上样顺序,确保最后成像的图片可用于文章发表。 Gel 1 BCA03/09/14 Well of...
(上样体积一般在10卩I与20卩I之间)(其实大一点的垂直电泳槽每孔最大上样量可以达到40卩I,胶做得很好的话,50卩I问题也不大)上样前要将样品100 C加热5-15min使蛋白变性,立即冰浴,然后低速离心5min。(可以使用PCR仪进行变性(95 C ,10 8、min)应根据上样缓冲液浓度的不同,制备样品。样品分装成小管,储...
取出上样样品至 200μl 的 EP 管中,加入 5×SDS 上样缓冲液至终浓度为 1×。(上样总体积一般不超过 15μl,加样孔的最大限度可加 20μ 样品,其实大一点的垂直电泳槽每孔最大上样量可以达到 40μl,胶做得很好的话 50μ 也是问题不大的)上样前要将样品于沸水中煮 5-10 min 使蛋白变性。
将准备上样的所有蛋白样品调至等浓度(一般上样量最多是20µg,体积是10µL,因此蛋白的终浓度控制在2µg/µL,但根据Biorad公司的说明,1.5mm的胶,大梳子每个孔最多上样66uL,但推荐最大上样是50μL,小梳子最多一个孔上样40μL),蛋白与5×SDS-PAGE Loading Buffer以4:1 混匀(体积比),1×loading...
Western blot的实验流程 Day1 一、配制蛋白分离胶 (一)所需材料和试剂 配胶用玻片、配胶用夹子、梳子、15mL离心管、不同量程移液枪、吸头; 聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成,聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂,...
可以。我通常都会在WB实验前一天把胶配好,浸泡于纯水中,4℃保存。次日使用时从冰箱取出恢复至室温后,再行后续上样、电泳。 3、梳子的选择 10孔 or 15孔。一是根据样本量的多少,其次就是上样体积的多少(微量加样枪头1mm/10孔15-20 uL,1.5mm/10孔 30-40 uL;1mm/15孔 10-15 uL, 1.5mm/15孔20-25 ...