可通过sgRNA设计软件筛选出移码突变率高且脱靶位点较少的sgRNA。 8.构建T7/U6启动子驱动sgRNA表达载体时,需注意sgRNA的5'碱基最好为G,或者人为添加一个G来提高其转录效率。 9.若要引发移码突变,必须将sgRNA设计在CDS区域,最好靠近编码蛋白的N端,最理想的位置是位于第一或第二外显子上,以生成无功能性蛋白。 1...
8、复制那段外显子的序列到sgRNA设计网站,http://crispor.tefor.net/(网站有很多); 9、输入上述已选中的同源区域的碱基序列,选择正确的物种和Cas9蛋白; 10、网站生成的sgRNA序列信息如下,包括sgRNA序列、PAM、此网站提供的特异性评分、切割效率评分、以及潜在的脱靶具体信息(建议sgRNA设计3-4条,利于高效完成); 11...
sgRNA设计示范 1、NCBI获取基因信息,选择编辑区域 2、设计、选择sgRNA FrCas9介绍 选择舒桐科技的优势 关于舒桐 CRISPR/Cas9是细菌和古生菌的一种抵御外来核酸物质入侵的防御系统,现被开发用来作为一种对特定靶序列进行基因编辑的技术。CRISPR/Cas9系统包含2个组件,一个是Cas蛋白,一个是sgRNA。sgRNA由crRNA和tracrRNA...
使用SnapGene软件对基因序列信息进行分析,如下图所示,WNT10B基因一共包含4个外显子,其中粉色区域为信号肽所在序列,该序列在蛋白质翻译加工过程中会被切除,sgRNA设计时应避免此段序列,最左边的的外显子序列也不参与蛋白质的翻译,也应该避免采用此段序列,所以最佳的sgRNA靶向...
CRISPR筛选设计 药物压力筛选法。通过高通量测序，比较对照组与实验组之间sgRNA种类的差异及丰度变化，确定基因敲除对细胞耐受药物或敏感性的影响。细胞分选法。利用FACS筛选出所需的细胞类群，并比较不同类群细胞之间sgRNA丰度，以达到功能性sgRNA的筛选目的。单细胞CRISPR筛选法。将CRISPR筛选与单细胞转录组测序(scRNA-...
sgRNA设计的一般流程如下：图1. sgRNA的设计流程 靶基因信息的分析 查询靶基因信息常用的数据库有NCBI、Ensembl等，在查询过程中要注意物种的选择和确定靶基因在数据库中的登录号，避免查找错误。查询到目的基因信息后，需进一步关注其所在基因座上下游基因情况、转录本数量、外显子数量及长度、翻译起始位点与终止位点等...
由于活性和特异性可能无法预测,因此可能需要为每个感兴趣的基因设计多个sgRNA。 高通量sgRNA文库筛选 高通量sgRNA文库筛选是用全基因组或特定通路的sgRNA文库在指定细胞内通过功能性筛选、富集以及随后的PCR扩增和深度测序分析,挖掘与表型相关的基因或在全基因组范围内筛选药物新靶点。CRlSPR/Cas9 gRNA文库筛选大体流程分为...
5.验证sgRNA的活性:在进行基因编辑实验之前,需要验证sgRNA的活性。可以通过以下方法进行验证: 细胞实验:将sgRNA导入细胞中,观察是否能够实现基因编辑。 体外切割实验:使用纯化的Cas蛋白和sgRNA进行体外切割实验,检测sgRNA对目标DNA的切割效率。 6.优化sgRNA设计:如果验证结果不理想,可以对sgRNA进行优化。优化的方法包括改变...
sgRNA设计及活性检测虚拟仿真软件利用计算机虚拟现实技术，通过三维重建和模拟实验等技术手段，还原真实实验场景和操作流程。学生可以通过软件直观地观察到sgRNA在CRISPR/Cas9系统中的关键作用，以及其在基因编辑过程中的动态变化。实验模拟与操作指导 sgRNA设计及活性检测虚拟仿真软件提供sgRNA设计的实验模拟功能，用户可以在虚拟...