PCR反应体系主要包含以下五种成分:模板(template)、引物(primers)、底物(dNTP)、DNA聚合酶、PCR缓冲液(PCR buffer)。 总结 PCR、qPCR、RT-PCR和RT-qPCR这四种技术都是基于聚合酶链式反应(PCR)的技术,主要区别在于它们的应用领域和检测目标不同。PCR主要用于DNA序列的扩增和检测;qPCR可以实时定量检测DNA或cDNA的含量...
QIAGEN One-Step RT-PCR Kit包含Omniscript逆转录酶和Sensiscript逆转录酶的混合物、HotStarTaq DNA Polymerase、QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer、dNTP混合液和Q-Solution。Q-Solution是一种新型的辅助剂,有助于实现“困难”模板(如:高GC含量的模板)的高效扩增。简单的单管反应体系构建和优化的试剂盒组分确保了结果成功...
RT-PCR已被广泛应用于多种分子生物学应用中,包括基因表达分析、基因测试、RNA干扰验证检测、微阵列验证、病原体检测和疾病研究。 RT-PCR的方法之一步法和两步法 RT-PCR其操作方法分为两种,即一步法和两步法。一步法RT-PCR,逆转录同PCR扩增结合在一起,即cDNA合成与...
① 取 0.5ml PCR 管,依次加入下列试剂:第一链 cDNA 2μl;上游引物(10pM) 2μl; 下游引物(10pM) 2μl;dNTP(2mM) 4μl;10×PCR buffer 5μl;Taq 酶(2u/μl) 1μl。 ② 加入适量的 ddH2O,使总体积达 50μl。轻轻混匀,离心。 ③ 设定 PCR 程序。在适当的温度参数下扩增 28-32 个循环。为了...
引物溶解:引物到手后可以先-20°C冻存,取用时,先室温放置5分钟,融化,接着高速离心,如12000rpm,10分钟。之后根据说明书放入一定量的TE buffer,振荡混匀。 一、PCR反应:(25ul反应体系) 每管内容:加样顺序及方法: ①. 1只Eppendorf管,依次加入:
RT Buffer(含 dNTP) 6 μL 6 μL MMLV 逆转录酶(含 RI) 2 μL 无 RT 引物(100ng/μL) 1 μL 1 μL RNase-free 水 补水到 20 μL 补水到 20 μL 9. 42℃保温 60 分钟。此步为 RT 反应。 10. 70℃保温 10 分钟以终止反应,然后放冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作 ...
PCR反应体系主要包含以下五种成分:模板(template)、引物(primers)、底物(dNTP)、DNA聚合酶、PCR缓冲液(PCR buffer)。 06 总结 PCR、qPCR、RT-PCR和RT-qPCR这四种技术都是基于聚合酶链式反应(PCR)的技术,主要区别在于它们的应用领域和检测目标不同。PCR主要用于DNA序列的扩增和检测;qPCR可以实时定量检测DNA或cDNA的...
原因:①模板不纯;②Buffer不合适;③退火温度偏低;④酶量过多;⑤dNTPs、Mg2+ 浓度偏高。 对策:①纯化模板;②更换 Buffer 或 mix;③适当提高退火温度;④按浓度比例设置酶的添加量;⑤适当降低 dNTPs 和 Mg2+ 浓度;⑥减少反应循环次数。 问题5:...
5. 10*逆转录合成缓冲液(10 RT buffer): 250 mmol/L Tris-HCl (pH8.3),375 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCl2 6. AMV 逆转录酶: 5u/L 7. 基因特异性5'和3'引物各20mol/L 8.Magigen Taq DNA 聚合酶5u/L 9. 10*PCR 缓冲液:500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris-Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0%...
反应体 系中已含有电泳所需的指试剂(蓝色和黄色),反应后可以 直接进行电泳。 在本试剂盒中,将耐热 M-MLV 反转录酶、Rnase Inhibitor、 Hotstart 高保真 DNA 聚合酶以及稳定剂等配制成 50×One-Step Enzyme Mix 预混液;反应 Buffer、dNTP 以及 电泳指示染料配制成 5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer,因此 使得...