RT-PCR已被广泛应用于多种分子生物学应用中,包括基因表达分析、基因测试、RNA干扰验证检测、微阵列验证、病原体检测和疾病研究。 RT-PCR的方法之一步法和两步法 RT-PCR其操作方法分为两种,即一步法和两步法。一步法RT-PCR,逆转录同PCR扩增结合在一起,即cDNA合成与...
1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液,微波炉中火30秒至沸腾,熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭 2.5μl,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中,在室温下放置30-45min后现进行电泳。 2、1.5%: 同上,将琼脂糖的量改为1.5g 六、需购置的Rt-PCR材料: (生工. Tel. 2236106.) Taq酶(含MgCl2 Buff...
复溶后加热2小时再加入模板扩增，与现配液体对照一致，试剂在这一过程中未发生性能损失。2、全组份预混液（含酶，buffer，即除引物探针外的所有组份），室温（20℃）放置7天后，上机检测。➣ 应用场景：客户反馈，在大批量生产中，需要预混液长时间在室温下分装，调配。另外还有一些未详细描述的实际应用。我们...
本产品提供的 PCR Mix在扩增结束后可以直接上样,不需要另外再加 loading buffer。PCR 产物阳性对照必须有预期条带出现,阴性对照必须无任何扩增,否则实验无效。对没有扩增产物的样品,可以稀释 10 倍后重复 PCR 扩增以排除 PCR 抑制剂的感染。 PCR常见问题的常见原因 1. cDNA产量的很低可能的原因: 1) RNA模板...
5. 10*逆转录合成缓冲液(10 RT buffer): 250 mmol/L Tris-HCl (pH8.3),375 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCl2 6. AMV 逆转录酶: 5u/L 7. 基因特异性5'和3'引物各20mol/L 8.Magigen Taq DNA 聚合酶5u/L 9. 10*PCR 缓冲液:500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris-Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0%...
对策:①纯化模板或者使用试剂盒提取模板 DNA 或加大模板的用量;②更换 Buffer 或调整浓度;③重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或者更换一管新引物;④降低退火温度、延长延伸时间。 问题2:非特异性扩增 原因:①引物特异性差;②模板或引物浓度过高;③酶量过多;④Mg2+浓度偏高。
5. 10*逆转录合成缓冲液(10 RT buffer): 250 mmol/L Tris-HCl (pH8.3),375 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCl2 6. AMV 逆转录酶: 5u/L 7. 基因特异性5'和3'引物各20mol/L 8.Magigen Taq DNA 聚合酶5u/L 9. 10*PCR 缓冲液:500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris-Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0%...
在存在DNA模板 + 引物 + 2x Taqmix(老式PCR试剂被分解为:dNTPs + 酶 + MgCl + buffer)的反应混合物中,在热稳定DNA聚合酶的催化下,实现对靶基因片段扩增。碱基通过Taq聚合酶添加到引物的3 '端。这会使DNA在5 '到3 '方向上延伸补充。在最佳条件下,DNA聚合酶的速度约为1000bp/分钟。Taq聚合酶可以耐受很高...
1.取0.5 ml PCR管,依次加入下列试剂:第一链cDNA 2 μl;上游引物(10 pM)2 μl;下游引物(10 pM)2 μl;dNTP(2 mM) 4 μl;10×PCR buffer 5 μl;Taq 酶(2 u/μl)1 μl; 2.加入适量的ddH2O,使总体积达50 μl。轻轻混匀,离心;
原因:①模板不纯;②Buffer不合适;③退火温度偏低;④酶量过多;⑤dNTPs、Mg2+ 浓度偏高。 对策:①纯化模板;②更换 Buffer 或 mix;③适当提高退火温度;④按浓度比例设置酶的添加量;⑤适当降低 dNTPs 和 Mg2+ 浓度;⑥减少反应循环次数。 问题5:...