05实时荧光定量逆转录PCR(Real-time RT-PCR, RT-qPCR) Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的组合。 PCR反应体系主要包含以下五种成分:模板(template)、引物(primers)、底物(dNTP)、DNA聚合酶、PCR缓冲液(PCR buffer)。 总结 PCR、qPCR、RT-PCR和RT-qPCR这四种技术都是基于聚合酶链式反应(PCR)的技术,主要区别...
QIAGEN One-Step RT-PCR Kit包含Omniscript逆转录酶和Sensiscript逆转录酶的混合物、HotStarTaq DNA Polymerase、QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer、dNTP混合液和Q-Solution。Q-Solution是一种新型的辅助剂,有助于实现“困难”模板(如:高GC含量的模板)的高效扩增。简单的单管反应体系构建和优化的试剂盒组分确保了结果成功...
PCR中，聚合酶是以DNA为模板的DNA聚合酶。RT-PCR中，逆转录酶是以RNA为模板的DNA聚合酶。2.缓冲体系不同：由于聚合酶不同，两者相应的反应buffer （RB）也略有不同。因为PCR有级联放大效应，buffer成分可能更复杂，以保证能减少非特异扩增。例如：10 × Taq 缓冲液成分：500 mM KCl, 100 mM Tris...
RT-PCR已被广泛应用于多种分子生物学应用中,包括基因表达分析、基因测试、RNA干扰验证检测、微阵列验证、病原体检测和疾病研究。 RT-PCR的方法之一步法和两步法 RT-PCR其操作方法分为两种,即一步法和两步法。一步法RT-PCR,逆转录同PCR扩增结合在一起,即cDNA合成与...
一、PCR反应:(25ul反应体系) 每管内容:加样顺序及方法: ①. 1只Eppendorf管,依次加入: MQ水: 17.5ul MQ水:17.5ul×___ 管= buffer: 2.5ul buffer: 2.5ul×___ 管= dNTP: 0.5ul dNTP: 0.5ul×___ 管= MgCl: 0.5ul MgCl: 0.5ul×___ 管= ...
(2)放入PCR仪,PCR反应过程如下: 95℃ 5 min 95℃ 30 s 60℃ 40 s 72℃50 s 循环30次 72 ℃ 8 min 2.3.3 PCR产物回收 按照TAKARA code no. 9761: TAKARA Minibest DNA Fragment Purification kit ver.4.0试剂盒操作回收扩增产物。 (1)向PCR反应液中加入3倍量的Buffer DC(如果需加入的Buffer DC量不...
3.取0.5 ml PCR管,依次加入下列试剂:第一链cDNA 2 μl;上游引物(10 pM) 2 μl;下游引物(10 pM) 2 μl;dNTP(2mM) 4 μl;10×PCR buffer 5 μl;Taq 酶(2 u/μl) 1 μl。轻轻混匀,离心。42℃孵育2-5 min; 4.加入SuperscriptⅡ1 μl ,在42℃水浴中孵育50 min; ...
对策:①提高预变性温度或变性时间,使双链完全打开;②TD-PCR(梯度 PCR );③换用热启动酶或 mix;④增加 DMSO 等共溶剂,协助 DNA 变性,降低引物 Tm 值,提高产物扩增特异性。 问题4:产物在凝胶上呈 Smear 状态 原因:①模板不纯;②Buffer不合适;③退火温度偏低;④酶量过多;⑤dNTPs、Mg2+ 浓度偏高。
Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的组合。 PCR反应体系主要包含以下五种成分:模板(template)、引物(primers)、底物(dNTP)、DNA聚合酶、PCR缓冲液(PCR buffer)。 06 总结 PCR、qPCR、RT-PCR和RT-qPCR这四种技术都是基于聚合酶链式反应(PCR)的技术,主要区别在于它们的应用领域和检测目标不同。PCR主要用于DNA序列...
5. 10*逆转录合成缓冲液(10 RT buffer): 250 mmol/L Tris-HCl (pH8.3),375 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCl2 6. AMV 逆转录酶: 5u/L 7. 基因特异性5'和3'引物各20mol/L 8.Magigen Taq DNA 聚合酶5u/L 9. 10*PCR 缓冲液:500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris-Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0%...