RT-PCR就是逆转录PCR(Reverse transcription PCR)或称为反转录PCR(Reverse transcription-PCR,RT-PCR),是以RNA为材料应用于PCR扩增中的一种实验方法。首先通过逆转录酶将总RNA或信使RNA(mRNA)转录成互补DNA(cDNA)。其次Taq DNA聚合酶以cDNA为模板进行qPCR扩增。RT-PCR已...
探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。 三. RT-qPCR具体实验步骤 引物设计: 除了遵循一...
在上下游引物的5'端分别加上了限制酶切位点、及其保护碱基(即 Hind III 和 BamH I),以便可以通过双酶切、将目的片段定向克隆到原核表达载体 pGFPUv上(图2)。 为了便于后续实验,可以用金属螯和层析的方法分离和纯化目的蛋白,我们改造了pGFPUv,在其上加了6×His 标签。 图2. pGFPUv质粒载体结构图 【试剂与器材...
在实验中,一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等,也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳...
一、本次RT-PCR实验目的 学习和掌握逆转录、RT-PCR基因扩增技术和操作方法,并深刻理解逆转录、RT-PCR基因扩增技术在功能基因克隆与载体构建过程中的重要性。 二、RT-PCR实验试剂和材料 大肠杆菌DH5a、Trizol试剂、逆转录试剂、PCR相关试剂、PCR产物克隆试剂、氯仿、异丙醇、DEPC水等。
PCR有很多种,其中RT-PCR,全称反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。 实验原理是在试管内,以变性-退火-延伸三个基本反应为一个循环,反复重复这种循环,使DNA得以扩增。其目的是检测核酸的表达,主要是RNA的表达,DNA不...
RT-PCR(qPCR)做为一个实验黑洞,让很多实验小白深陷其中,无法自拔。尤其是其不同于常规PCR的数据结果更是让菜鸟们感到高深莫测以及不知所措。因而,为了让大家早日从菜鸟晋升为qPCR小达人,本文这就将RT-PCR的进阶实验宝典分享给大家。 RT-PCR的定量原理
实验二、PCR/RT-PCR基本原理及过程 前言:PCR主要围绕DNA、RNA所做的科研活动。核糖核酸(缩写为RNA,即RibonucleicAcid),存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体;脱氧核糖核酸是分子结构复杂的有机化合物。作为染色体的一个成分而存在于细胞核内。功能为储藏遗传信息。(病毒与人类共存,人类和病毒一直...
(1)引物的特异性决定PCR反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。 在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列,同种蛋白的不同亚型,不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物,或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的...
为了将扩增的cDNA同沾染的基因组DNA扩增产物分开,可以设计分别同分开的外显子退火的引物。来源于cDNA的PCR产物会比来源于沾染的基因组DNA 的产物短。另外对每个RNA模板进行一个无逆转录的对照实验,以确定一个给定片段是来自基因组DNA还是cDNA。在无逆转录时所得...