逆转录RT-PCR把以RNA为模板的cDNA合成(即 RNA的反转录)与cDNA 的 PCR 结合在一起,提供了一种基因表达检测、定量和 cDNA克隆的快速灵敏的方法。由于 cDNA 包括了编码蛋白的完整序列,而且不含内含子,只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究,因此RT-PCR成为目前获得目的基因的一种重要手段。 首先是在逆转...
RT-PCR操作步骤 RT-PCR步骤 一、总RNA提取 1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。2. 震荡30s。3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。4. 12000×g，4℃离心，15min。5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。7. 12000×g，4℃离心...
下面将介绍RT-PCR的操作流程。 首先,准备实验所需的试剂和设备,包括RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR试剂盒、热循环仪等。确保所有试剂和设备都处于干净、无菌状态。 第二步是提取RNA样本。将待检测的样本(如血液、组织等)加入RNA提取试剂盒中,按照试剂盒说明书的指导进行RNA提取。提取后的RNA样本应该是纯净的,...
实验操作过程中必须戴口罩、手套,实验室尽量避免人员干扰。 RT-PCR的试剂都应在冰上融化,等完全融化后再取;用过的试剂应瞬间离心后放回-20℃保存;试剂应按顺序加,加完后再混匀离心。 加入试剂前在管壁上做好标记,避免加错试剂;加过一种试剂后将EP管盖子的方向改变,避免重复和漏加;不同试剂和样品要更换吸...
4.实时荧光定量PCR:将cDNA与引物和荧光探针(如TaqMan探针)混合,使其在PCR过程中扩增,并且实时检测扩增产物的荧光信号强度,从而判断PCR反应的进程和结果。 5.数据分析:利用软件分析PCR扩增曲线和荧光信号数据,计算目标基因的相对表达量和差异表达水平。 需要注意的是,RT-PCR操作需要严格控制反应条件和质量,避免污染和误...
【实验】普通PCR、荧光定量RT-qPCR、数字PCR的基本原理和操作方法,注意事项,SYBR GREEN, Taq Man探针, 视频播放量 6159、弹幕量 0、点赞数 322、投硬币枚数 94、收藏人数 961、转发人数 58, 视频作者 植物百科, 作者简介 一个实验型up,偶尔猎奇。,相关视频:SYBR荧光定
RT-PCR实验有三步:抽提RNA,RT,PCR。 试验前注意: 1. 做RT前必需测RNA浓度,逆转录体系对RNA量还是有一些要求,常用500ng或1ug。 2. RT按要求做,一般不会出太大问题。 3. PCR如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的cDNA存在,不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
RT-PCR技术操作流程 简介 RT-PCR是利用反转录酶催化dNTPs聚合成与mRNA模板互补的单链DNA(即cDNA)，以cDNA为模板在PCR反应系统中进行扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳法检测RT-PCR产物，从而间接检测mRNA的方法。工具/原料 PCR仪、台式离心机、低温高速离心机、旋涡混匀器、稳压稳流电泳仪、水平电泳槽、紫外凝胶分析系统等...
第二步 RT-PCR操作步骤 一、RNA逆转录cDNA(反应体系要20ul)依次加入 1、Oligo(dT)加入1ul。 2、RNA(体积即上一步骤计算出来的) 3、剩下的用无Rnase水补齐共12ul 65℃水浴5min。 二、加入逆转录试剂 1、5×Reaction Buffer 4ul 2、Ribolock RNase Inhibiter 1ul ...