实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)是一种结合逆转录与实时荧光定量PCR的技术,用于RNA的定量分析。其核心是通过逆转录将RN
一. RT-qPCR 基本原理和概念实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 以cDNA 为模板进行 PCR,在 PCR 扩增过程中,通过收集荧光信号,对 PCR进程进行实时...
RT-qPCR技术的全称是实时荧光定量逆转录PCR(Real-time Reverse Transcription - PCR)。这是一种将逆转录反应(RT)与实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)相结合的分子生物学技术,其原理及步骤如下: 一、技术原理 RT-qPCR以RNA为起始材料,主要分为两个阶段: 逆转录阶段(RT):此阶段运用逆转录酶以RNA为模板形成互补的...
2)简化版方式:根据板间校正的原理,主要控制的是各板之间的内参基因,因此:如果使用的qPCR体系完全一致(包括样本、酶、qPCR板子/膜、仪器等),重复实验相隔时间很近,内参基因在两次实验之间CT值相差很小(0.5以内),整体重复量并不是特别大(如96×3<384)则可能可以考虑,在各板各自计算相对表达量之后,将2^{-\Delta...
其原理主要包括三个方面:逆转录、PCR扩增和实时荧光定量检测。 1. 逆转录 rt-qpcr实验首先需要将RNA转录为cDNA,这是通过逆转录酶(Reverse Transcriptase)催化的反应来实现的。逆转录酶可以将RNA模板转录成相应的cDNA,为后续的PCR扩增提供模板。 2. PCR扩增 在cDNA合成完成后,接下来是PCR扩增反应。PCR扩增需要引物(...
RT-qPCR原理的三个主要步骤: 1、反转录: 1.1、使用逆转录酶和特定引物将RNA样品反转录成cDNA。 1.2、该步骤将RNA模板转化为更稳定且可扩增的DNA形式。 1.3、反转录过程中使用特定引物。 2、PCR扩增: 2.1、使用特定引物对cDNA进行PCR扩增,这些引物环绕目标区域。
RT-qPCR 对照 一个逆转录阴性对照(-RT对照)应该包括在所有的 RT-qPCR 的实验中,以检测 DNA 污染(如基因组 DNA 或来自之前反应的 PCR 产物)。这一对照包含除逆转录酶之外的所有反应组分。由于该对照不会发生逆转录,因此如果观察到 PCR 扩增,则极有可能来自 DNA 的污染。
RT-QPCR操作流程 1)样本处理 植物组织:以叶片 RNA 提取为例。取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在TRNzol试剂中研磨,研磨要迅速,最好不要超过 1 min 。大约 100 mg 叶片使用 1 ml TRNzol 试剂。 动物组织:以鼠肝脏 RNA 提取为例。取新鲜或-70℃冻存组织,每 100 mg 组织加入 1 ml TRNzol 试...