探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。 三. RT-qPCR具体实验步骤 引物设计: 除了遵循一...
RNA提取一般可以使用专业的商品化RNA提取试剂盒,按说明书操作即可,或者TRlzol试剂提取,具体步骤如下: (1) 样品准备:贴壁细胞:6孔板取1个孔的细胞加入1ml Trizol,室温裂解10 min;悬浮细胞:离心沉淀细胞,每5-10×10^6个细胞加入1ml Trizol室温裂解10 min;组织:50-100mg新鲜组织装入1.5ml EP管放入液氮急冻,加入1...
PCR反应一般分为三个步骤:变性、退火和延伸。 1)变性,是将DNA或RNA模板解离成单链,通常在95℃下进行;具体可参考试剂商提供的手册,95℃ 15s一般适用。 2-3)退火,是引物与DNA或RNA模板结合的过程,通常在55-65℃下进行(一般来说,引物的加入是过量的,引物的设计可参考文章:超全!PCR跨内含子引物设计:从理论到...
RT-qPCR原理的三个主要步骤: 1 反转录: 使用逆转录酶和特定引物将RNA样品反转录成cDNA。 该步骤将RNA模板转化为更稳定且可扩增的DNA形式。 反转录过程中使用特定引物。 2PCR扩增: 使用特定引物对cDNA进行PCR扩增,这些引物环绕目标区域。 PCR是一个循环过程,呈指数级扩增DNA模板的数量。 PCR反应中包含荧光染料或探...
一、逆转录(RT)步骤: 在进行RT-qPCR之前,首先需要将RNA样本逆转录成互补DNA (cDNA)。这是因为DNA聚合酶只能作用于DNA模板,而并非RNA。逆转录酶是一种特殊的酶,它能够以RNA为模板合成与其互补的DNA单链。这个步骤对于后续的qPCR至关重要,因为它将不稳定的RNA分子转化为更稳定的cDNA分子,便于后续的扩增和定量分析...
RT-qPCR原理的三个主要步骤: 1、反转录: 1.1、使用逆转录酶和特定引物将RNA样品反转录成cDNA。 1.2、该步骤将RNA模板转化为更稳定且可扩增的DNA形式。 1.3、反转录过程中使用特定引物。 2、PCR扩增: 2.1、使用特定引物对cDNA进行PCR扩增,这些引物环绕目标区域。
7.结果验证要进行多种方法的验证,以确保结果的准确性。 8.在实验过程中要注意安全,避免接触有毒有害物质。 以上是一般的RT-qPCR操作流程,具体的操作步骤可能会因实验目的、样本类型和使用的试剂盒而有所不同。在进行实验前,应仔细阅读相关的实验指南和试剂盒说明书,并根据实际情况进行适当的调整。©...
试剂 步骤 1 的反应液 Prime Script RT Enzyme Mix I RT Primer Mi 5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time) RNase Free dH2O Total 使用量 10ul 1ul 1ul 4ul 4ul 20ul 2 (2)轻轻震荡混匀后,微量离心机离心。 3.cDNA 第一链合成反应 按照不同试剂盒要求,对金属浴进行设置。 (四)RT-qPCR 1.配置反...
实时荧光定量PCR仪器的核心组件之一是热循环装置，它能够控制PCR反应体系的温度变化。热循环装置通常由Peltier温度控制模块构成，能够快速、精确地调节反应体系的温度，通常包括加热和冷却功能，能够在不同的PCR反应步骤中（如变性、退火、延伸）快速切换温度，以满足PCR反应的要求。光学检测系统 实时荧光定量PCR仪器配备了高...