其原理主要包括三个方面:逆转录、PCR扩增和实时荧光定量检测。 1. 逆转录 rt-qpcr实验首先需要将RNA转录为cDNA,这是通过逆转录酶(Reverse Transcriptase)催化的反应来实现的。逆转录酶可以将RNA模板转录成相应的cDNA,为后续的PCR扩增提供模板。 2. PCR扩增 在cDNA合成完成后,接下来是PCR扩增反应。PCR扩增需要引物(...
RT-qPCR是一种对特定DNA进行定量分析的方法，其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行荧光定量PCR，在PCR扩增过程中，通过收集荧光信号，对PCR进程进行实时检测。在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性...
一. RT-qPCR 基本原理和概念实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 以cDNA 为模板进行 PCR,在 PCR 扩增过程中,通过收集荧光信号,对 PCR进程进行实时...
图1.一步法与两步法RT-qPCR 优点缺点 一步法 由于两步反应都在一个管中完成,因此该方法具有更少的实验误差 更少的移液步骤能够减少污染的风险 适用于高通量扩增/筛选,快速且可重现性高 无法分别对两步反应进行优化 由于反应条件是结合两步反应折衷得到的,因此灵敏性不如两步...
【实验】激光扫描共聚焦显微镜的原理及操作方法、注意事项 13:46 【实验】流式细胞技术的原理及操作方法、注意事项 22:37 【实验】细胞破碎方法,超声破碎仪,高压均质机的原理,使用方法,注意事项,破碎率的测定 26:00 【实验】普通PCR、荧光定量RT-qPCR、数字PCR的基本原理和操作方法,注意事项 19:05 【实验...
1. RT-qPCR的一步法与两步法 1)一步法:将逆转录与PCR扩增结合在一起,使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。由于两步反应都在一个管中完成,因此该方法具有更少的实验误差和移液步骤,减少污染的风险。 2)两步法:将逆转录和PCR扩增过程分开,在两个管中完成检测。需要使用不同的缓冲液、...
RT-qPCR 可以按一步法或两步法进行(图1、表1)。一步法检测是在一个反应管和缓冲液中进行反转录和PCR,同时使用反转录酶和 DNA 聚合酶。一步法 RT-qPCR 仅使用序列特异性引物。在两步法中,反转录步骤和 PCR 扩增步骤在独立的管中进行,采用不同的优化缓冲...
RT-QPCR (实时荧光定量) 1.原理:基于PCR反应的技术提升与延伸,有染色法和荧光探针法。 2.优点:对扩增反应进行实时监测 对初始DNA进行定量 灵敏度高 3.步骤(染色法): 染料法中使用的荧光物质是可与DNA结合的发光化学染料(SYBR Green I)。 SYBR Green I是一种使用广泛的荧光标记染料,它可以结合到双链DNA分子...