其原理主要包括三个方面:逆转录、PCR扩增和实时荧光定量检测。 1. 逆转录 rt-qpcr实验首先需要将RNA转录为cDNA,这是通过逆转录酶(Reverse Transcriptase)催化的反应来实现的。逆转录酶可以将RNA模板转录成相应的cDNA,为后续的PCR扩增提供模板。 2. PCR扩增 在cDNA合成完成后,接下来是PCR扩增反应。PCR扩增需要引物(...
图1.一步法与两步法RT-qPCR 优点缺点 一步法 由于两步反应都在一个管中完成,因此该方法具有更少的实验误差 更少的移液步骤能够减少污染的风险 适用于高通量扩增/筛选,快速且可重现性高 无法分别对两步反应进行优化 由于反应条件是结合两步反应折衷得到的,因此灵敏性不如两步...
图1.一步法与两步法RT-qPCR 优点缺点 一步法 由于两步反应都在一个管中完成,因此该方法具有更少的实验误差 更少的移液步骤能够减少污染的风险 适用于高通量扩增/筛选,快速且可重现性高 无法分别对两步反应进行优化 由于反应条件是结合两步反应折衷得到的,因此灵敏性不如...
一. RT-qPCR 基本原理和概念实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 以cDNA 为模板进行 PCR,在 PCR 扩增过程中,通过收集荧光信号,对 PCR进程进行实时...
一般情况下,抓住下面三点并结合原理即可判断其他异常情况: 1)CT值:在计算之前,检查CT值的可信度,一般CT值应该在25±10(15-35)之间,最多放大到25±15(10-40),但一般来说通常将CT值在25到30之间作为检测结果的临界值。 2)扩增曲线:一般呈“S型”,如果扩增曲线呈“指数型”(图 2.2,来源:QPCR-如何判断引物...
由于qPCR是实时定量检测致病病原体基因核酸，因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到优势。关于名称 根据MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）的指导方针，qPCR为Quantitative real-time PCR的简称，RT-qPCR指的是Reverse transcription–qPCR，RT-PCR仅...
RT-qPCR反应所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下: 1、TaqMan荧光探针 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。 图3:图片来源于网络,若有侵权联系删除 ...
RT-qPCR原理的三个主要步骤: 1 反转录: 使用逆转录酶和特定引物将RNA样品反转录成cDNA。 该步骤将RNA模板转化为更稳定且可扩增的DNA形式。 反转录过程中使用特定引物。 2 PCR扩增: 使用特定引物对cDNA进行PCR扩增,这些引物环绕目标区域。 PCR是一个循环过程,呈指数级扩增DNA模板的数量。