RT-qPCR的第一步是对靶基因设计特异性的引物,引物设计的好坏,关乎着扩增效率的高低、产物特异性的与否,所以引物设计是实验成功的第一步。引物设计有以下几个原则:(1) 引物最好跨内含子设计(此原则下设计的引物将不受反转录试剂盒中是否含有gDNA Remover的影响);(2) 引物长度一般在18~30 nt之间,扩增产物...
其原理主要包括三个方面:逆转录、PCR扩增和实时荧光定量检测。 1. 逆转录 rt-qpcr实验首先需要将RNA转录为cDNA,这是通过逆转录酶(Reverse Transcriptase)催化的反应来实现的。逆转录酶可以将RNA模板转录成相应的cDNA,为后续的PCR扩增提供模板。 2. PCR扩增 在cDNA合成完成后,接下来是PCR扩增反应。PCR扩增需要引物(...
RT-qPCR逆转录过程 总RNA与mRNA的选择 在设计RT-qPCR实验过程中,决定是否要使用总RNA或纯化的mRNA作为模板进行逆转录十分重要。尽管mRNA可能能够提供略高的灵敏度,但总RNA仍经常使用。其原因是总RNA作为起始材料具有较mRNA更重要的优势。首先,其过程需要较少的纯化步骤,这确保了...
一. RT-qPCR 基本原理和概念实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 以cDNA 为模板进行 PCR,在 PCR 扩增过程中,通过收集荧光信号,对 PCR进程进行实时...
【实验】激光扫描共聚焦显微镜的原理及操作方法、注意事项 13:46 【实验】流式细胞技术的原理及操作方法、注意事项 22:37 【实验】细胞破碎方法,超声破碎仪,高压均质机的原理,使用方法,注意事项,破碎率的测定 26:00 【实验】普通PCR、荧光定量RT-qPCR、数字PCR的基本原理和操作方法,注意事项 19:05 【实验...
2)简化版方式:根据板间校正的原理,主要控制的是各板之间的内参基因,因此:如果使用的qPCR体系完全一致(包括样本、酶、qPCR板子/膜、仪器等),重复实验相隔时间很近,内参基因在两次实验之间CT值相差很小(0.5以内),整体重复量并不是特别大(如96×3<384)则可能可以考虑,在各板各自计算相对表达量之后,将2^{-\Delta...
RT-QPCR 基本原理和概念 实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过在PCR反应体系中加入荧光染料(SYBR Green)或荧光标记的特异性的探针,与DNA产物特异性结合,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可...