如下图所示,泳道上部有明显的高分子杂带,则可能有gDNA的残留,不建议用于后续的qPCR实验,会对实验的准确性造成影响。 图2. 高质量RNA(左)和RNA中有gDNA(右) 如果逆转录前没有确认模板中是否含有gDNA,可以在qPCR实验中设立NRC阴性对照组(以未逆转录的RNA作为模板)验证,如下图所示,NRC具有明显的扩增,表明RNA中可...
反应结束后确认RT-qPCR 的扩增曲线和融解曲线,进行 PCR 定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器操作手册。 5.数据分析 一般有相对定量和绝对定量两种分析方法,相对定量是检测实验组和对照组中靶基因的倍数差异,特别适合在对RNA模板的数量不能精确定量,或者只需要知道目的基因的表达差异时,另外,相对定量需要进行归一化...
反应结束后确认RT-qPCR 的扩增曲线和融解曲线,进行 PCR 定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器操作手册。 5.数据分析 一般有相对定量和绝对定量两种分析方法,相对定量是检测实验组和对照组中靶基因的倍数差异,特别适合在对RNA模板的数量不能精确定量,或者只需要知道目的基因的表达差异时,另外,相对定量需要进行归一化...
一个逆转录阴性对照(-RT对照)应该包括在所有的 RT-qPCR 的实验中,以检测 DNA 污染(如基因组 DNA 或来自之前反应的 PCR 产物)。这一对照包含除逆转录酶之外的所有反应组分。由于该对照不会发生逆转录,因此如果观察到 PCR 扩增,则极有可能来自 DNA 的污染。 参考文献 Bustin S. (ed) (2004) A-Z of Quant...
RT-qPCR是通过检测反应体系中的荧光强度来检测PCR扩增产物的,其荧光标记方法分为两种:荧光染料嵌合法和荧光探针法。 1.荧光染料嵌合法 荧光染料嵌合法即应用一种带有荧光的、非特异的DNA结合染料检测PCR过程中积累的扩增产物。常用SYBR Green I染料,该染料在游离状态下几乎不会产生荧光,可以非特异地结合在双链DNA的...
如果逆转录前没有确认模板中是否含有gDNA,可以在qPCR实验中设立NRC阴性对照组(以未逆转录的RNA作为模板)验证,如下图所示,NRC具有明显的扩增,表明RNA中可能含有gDNA污染。 图3. qPCR扩增曲线图。NRC:阴性对照组 了解了如何识别gDNA污染,那么如何去除呢?通常可以在RNA提取时或逆转录前用DNA酶或gDNA清除剂去除gDNA。
如果反转录酶没有Rnase酶活性,可加入RNaseH来获得更高的qPCR效率。常用的酶包括Money鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶和禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶。依据RT-PCR,理想的状态下是选择具有较高热稳定性的反转录酶,cDNA的合成才能在较高的温度下进行,确保成功转录具有较高...
实时荧光RT-PCR技术(RT-qPCR)利用荧光标记探针对扩增产物量进行实时跟踪,再根据扩增曲线计算出起始模板量,即样本病毒载量。如图是利用RT-qPCR进行新冠肺炎病毒(SARS-CoV-2)载量测定的主要过程。请据图回答:(1)过程①中,RNA提取裂解液可同时灭活病毒,原因是 ___。采集到的样本要迅速进行病毒灭活处理,其目的是...
或5μl RNA提取试剂盒中的洗脱缓冲液,作为阴性对照,或5μl PCR级水作为无模板对照,或5μl阳性对照。 (4)扣紧PCR管,然后短暂离心。 (5)将PCR管放置qPCR仪上,盖好盖。 步骤3. 在qPCR仪上设置反应程序, 示例: 1 cycle 50 °C for 20 min
RT-qPCR结果的判读通常遵循以下标准: 1.阈值循环(Threshold Cycle,Ct值): - Ct值是指达到检测阈值时的循环次数,它反映了样本中目标RNA的初始浓度。 - Ct值越低,表示目标RNA的浓度越高。 -通常,Ct值低于某个特定值(如30或35)被认为是阳性结果,高于这个值则认为是阴性结果。 2.相对表达量: -相对表达量是...