qPCR实质上是一种PCR扩增反应，但它与普通PCR有所不同。普通PCR是将的得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过核酸染料染色并借助紫外凝胶成像仪进行观察，最后通过终产物进行定性或者半定量分析；qPCR是在反应体系中引入荧光基团（染料或者探针），进而对qPCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应的过程，结合相应的qPCR仪自...
3 实时荧光定量 PCR (qPCR)实时荧光定量 PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR) 是 DNA 的实时 PCR 扩增，通过荧光探针测量，最常见的是插入染料或基于水解的探针，从而实现 PCR 产物的定量 (见图 2)。该技术常用于检测病原体的存在和确定感兴趣的 DNA 序列的拷贝数。图 2. qPCR 流程图[11]。同样要经过...
RT-PCR技术中主要的曲线有下面三种: 1. 扩增曲线 随着实验的进行,扩增产物不断累积,相应的荧光信号也不断在增加,每进行一个循环就采集一次荧光的信号,经过一定的循环数后(比如40个循环),就可以得到下面的扩增曲线图(横坐标代表扩增的循环数cycle,纵坐标代表荧光的强度)。 这其中还需要弄清楚一些基本概念,如: 基...
(2)假如只是想看看扩增效率(E)(E=10-1/斜率),检验PCR旳反应体系与否符合规定,我们有时候也采用待测试样品作为原则品,逐渐稀释后进行反应,最终看原则曲线旳斜率和R2与否符合规定,我比较懒,常会用这种措施,不过有些发文章旳规定会比较高,那还是要乖乖去做旳。3.溶解曲线 简朴点说,就是考察染料标识法成果旳特异...
RT-PCR技术中主要的曲线有下面三种: 1. 扩增曲线 随着实验的进行,扩增产物不断累积,相应的荧光信号也不断在增加,每进行一个循环就采集一次荧光的信号,经过一定的循环数后(比如40个循环),就可以得到下面的扩增曲线图(横坐标代表扩增的循环数cycle,纵坐标代表荧光的强度)。
1.熔解曲线出现双峰 1)双峰,杂峰Tm在80℃之前 ①可能存在引物二聚体,建议降低引物浓度或重新设计引物等方式优化。 ②可能是模板量过低,促使了引物二聚体的形成,建议提高模板量。 2)双峰,杂峰Tm在80℃之后 ①引物特异性过差导致...
图3. 染料法熔解曲线 2)扩增曲线:将已知浓度的靶标稀释几个数量级后进行qPCR反应循环扩增,并用产生的荧光信号与相应浓度生成标准曲线。将未知样本的Ct值与该标准曲线进行比对,可以确定其浓度。 荧光阈值是PCR 3-15个循环荧光信号标准差的10倍(荧光阈值要设定在PCR扩增的指数期)。qPCR的扩增曲线与荧光阈值交点对应...
基线:指在PCR扩增反应的最初的几个循环里,荧光信号变化不大。接近一条直线,该直线叫做基线。这个了解即可,对实验操作没什么影响。 阈值线:一般来说,前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,阈值的设定就是3-15个循环荧光信号标准差的10倍,在PCR扩增的指数期(如图中箭头所指)。 说的这么严肃,其实很多仪器自动设定...
这是一个相当标准的RT-PCR扩增图,我们可以看到一些漂亮的曲线,每条曲线都有熟悉的指数增长期、线性增长期和平台期。但是,在早期循环当中,我们看到的线条是杂乱无章的,这些对我们的检测并没有用处,它属于,也就是我们常说的,噪音。 ‘噪音’是在实际信号放大到足以克服这些背景杂音之前,设备所采集到的相关信号值,它...
今天将深入为大家解读RT-PCR技术中旳某些曲线,但愿大家对此有更深入旳认识。RT-PCR技术中重要旳曲线有下面三种:1.扩增曲线伴随试验旳进行,扩增产物不停累积,对应旳荧光信号也不停在增长,每进行一种循环就采集一次荧光旳信号,通过一定旳循环数后(例如40个循环),就可以得到下面旳扩增曲线图(横坐标代表扩增旳循环数...