如果引物二聚体存在则阴性对照会出现抬头现象，这在Real-Time PCR中很难避免；若是阴性对照的溶解曲线出现和样品中同样的峰，说明体系配置中存在污染，则实验结果不可用。想了解更多精彩内容，快来关注核酸检测试剂盒邦景 在溶解曲线中出现双峰有三种可能：1、引物峰，引物峰通常是两峰中的前面一个，消除的办法是...
Rt PCR溶解曲线中出现双峰原因有什么 2023年11月17日 在溶解曲线中出现双峰有三种可能: 1、引物峰,引物峰通常是两峰中的前面一个,消除的办法是降低体系中的引物量或重新设计引物; 2、在做基因表达差异时容易出现DNA被扩增峰(只在引物跨内含子时存在),出现原因是提取RN...
再以cDNA为模板进行荧光定量PCR，在PCR扩增过程中，通过收集荧光信号，对PCR进程进行实时检测。在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，以此对模板进行定量。在实时PCR扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。那么首先我们来看几个基本概念：基线，荧光阈值和Ct值。基线（basel...
如果出现了双峰,则要考虑是否引物设计不合理或者引物过量引起溶解曲线出现多峰的情况。 5. 如果前面的几项都没有太大的问题的话。最后我们看看最重要的结果,也就是目的基因的变化情况了。在内参与对照组选择没错的情况下,点击 gene expression 选项,选中你想查看的样品孔的基因表达情况。 好了,这次的 RT-PCR 看...
不加CDNA，只加目的基因引物的溶解曲线 会出现双峰，但是目的基因的没有双峰。不知道是不是有二聚物...
图3.溶解曲线和溶解温度示意图 当PCR循环反应完成之后,系统会测定熔解曲线,反应体系从60℃加热到90℃,然后每隔一定时间测定荧光强度,随着温度升高,dsDNA双链解开,SYBR Green I染料脱落,荧光值逐渐下降,就形成了一个温度和荧光强度的曲线。当加热到一定温度时,曲线会陡降,这个温度就是Tm值。我们将荧光强度对温度的...
对于没有很多钱的实验室来说,在拿到很多引物的时候,可以通过普通的 RT-PCR 看看是否是单一条带,鉴定一下引物的特异性。如果实验室不差钱,则可以通过溶解曲线对所有的引物的特异性做一次鉴定。 SYBR 要避免强光照射,所以在加 SYBR 试剂的时候尽量关掉头顶的照明灯,只需借助微光完成就可以。
另外，你荧光定量PCR的产物长度有点长啊，都491bp了，一般200bp左右就可以了。反过来倒是您的标准质 ....
图3.溶解曲线和溶解温度示意图 当PCR循环反应完成之后,系统会测定熔解曲线,反应体系从60℃加热到90℃,然后每隔一定时间测定荧光强度,随着温度升高,dsDNA双链解开,SYBR Green I染料脱落,荧光值逐渐下降,就形成了一个温度和荧光强度的曲线。当加热到一定温度时,曲线会陡降,这个温度就是Tm值。我们将荧光强度对温度的...
图3.溶解曲线和溶解温度示意图 当PCR循环反应完成之后,系统会测定熔解曲线,反应体系从60℃加热到90℃,然后每隔一定时间测定荧光强度,随着温度升高,dsDNA双链解开,SYBR Green I染料脱落,荧光值逐渐下降,就形成了一个温度和荧光强度的曲线。当加热到一定温度时,曲线会陡降,这个温度就是Tm值。我们将荧光强度对温度的...