图3.溶解曲线和溶解温度示意图 当PCR循环反应完成之后，系统会测定熔解曲线，反应体系从60℃加热到90℃，然后每隔一定时间测定荧光强度，随着温度升高，dsDNA双链解开，SYBR Green I染料脱落，荧光值逐渐下降，就形成了一个温度和荧光强度的曲线。当加热到一定温度时，曲线会陡降，这个温度就是Tm值。我们将荧光强度对...
图3.溶解曲线和溶解温度示意图 当PCR循环反应完成之后,系统会测定熔解曲线,反应体系从60℃加热到90℃,然后每隔一定时间测定荧光强度,随着温度升高,dsDNA双链解开,SYBR Green I染料脱落,荧光值逐渐下降,就形成了一个温度和荧光强度的曲线。当加热到一定温度时,曲线会陡降,这个温度就是Tm值。我们将荧光强度对温度的...
这里要引入一个概念——熔解曲线。 图3.溶解曲线和溶解温度示意图 当PCR循环反应完成之后,系统会测定熔解曲线,反应体系从60℃加热到90℃,然后每隔一定时间测定荧光强度,随着温度升高,dsDNA双链解开,SYBR Green I染料脱落,荧光值逐渐下降,就形成了一个温度和荧光强度的曲线。当加热到一定温度时,曲线会陡降,这个温度...
这里要引入一个概念——熔解曲线。 图3.溶解曲线和溶解温度示意图 当PCR循环反应完成之后,系统会测定熔解曲线,反应体系从60℃加热到90℃,然后每隔一定时间测定荧光强度,随着温度升高,dsDNA双链解开,SYBR Green I染料脱落,荧光值逐渐下降,就形成了一个温度和荧光强度的曲线。当加热到一定温度时,曲线会陡降,这个温度...
图3.溶解曲线和溶解温度示意图 当PCR循环反应完成之后,系统会测定熔解曲线,反应体系从60℃加热到90℃,然后每隔一定时间测定荧光强度,随着温度升高,dsDNA双链解开,SYBR Green I染料脱落,荧光值逐渐下降,就形成了一个温度和荧光强度的曲线。当加热到一定温度时,曲线会陡降,这个温度就是Tm值。我们将荧光强度对温度的...
溶解曲线 1)溶解曲线是为了验证扩增产物特异性,一般是单峰,和模板的浓度无关。 2)一般SYBR法的目的基因在80~90℃之间。 3)若出现其他峰,可能是引物二聚体导致需要优化引物序列、引物加量等因素。 图6:溶解曲线 注意事项 (1) 请确保引物的正确性和特异性。通常引物终浓度0.2 μM...
荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR)是通过检测DNA双链结合的染料,是 SYBR® Green I对DNA扩增过程中的起始量进行定量监测的技术手段。qPCR实验结果包含扩增曲线和溶解曲线。 1.扩增曲线 1)正常的扩增曲线一般呈S型、有明显的四个时期,Ct值在20-30之间,且复孔的Ct值尽量一致,相差不要超过0.5个Ct值(上限...
荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR)是通过检测DNA双链结合的染料,是 SYBR® Green I对DNA扩增过程中的起始量进行定量监测的技术手段。qPCR实验结果包含扩增曲线和溶解曲线。 1. 扩增曲线 1)正常的扩增曲线一般呈S型、有明显的四个时期,Ct值在20-30之间,且复孔的Ct值尽量一致,相差不要超过0.5个Ct值(上限...
一般来说,OD260/280=1.8-2.1,证明纯度较好,值得一提的是,OD260/280的比值会受到pH的影响,当用中性的水溶解RNA时候,RNA呈酸性,比值可能只有1.8-2.0之间;当用TE溶解RNA时,比值会稍偏高,可能在1.9-2.1之间。 1)OD260/280<1.8,可能有蛋白质或基因组的残留; ...
5. 溶解曲线不止一个主峰 引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现。 引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比。 镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度,或选择更合适的 mix 试剂盒。 模板有基因组的污染:RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免...