通过 PCR 反应生成双链 DNA,TB Green 与双链 DNA 结合发出荧光,通过检测PCR 反应液中的荧光信号强度,可以对目的基因进行准确定量,同时还可以测定扩增的目的 DNA 片段的融解温度。 反应体系的配制和PCR仪还有关系,不同的PCR仪,配制PCR 反应液可能不同,具体参照试剂的说明书和按照不同仪器的操作手册提供的方法操作。
2 病原体检测：采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。3 药物疗效考核：对乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型...
RT-PCR是一种从细胞RNA (mRNA)中高效灵敏地扩增cDNA序列的方法,它由两大步骤组成:一步是反转录(RT),另一步是PCR。获得总RNA或mRNA后,即可进行RT-PCR。首先,在反转录酶作用下将RNA(mRNA)反转录成cDNA,以该cDNA第一链为模板进行PCR扩增,根据靶基因设计用于PCR扩增的基因特异的上下游引物,基因特异的上游引物与c...
肠道菌群测定方法 RT-PCR肠道菌群测定方法 实时荧光定量PCR(RT-PCR) 粪便标本采集及DNA提取,所用研究标本均于排便后迅速收集于无菌培养皿内,并迅速置于-80度超低温冰箱内保存。称取0.2g粪便,提取粪便细菌DNA,-20度保存。 参考既往文献报道,根据菌群16srRNA序列设计总细菌、球形梭菌类群、柔嫩梭菌类群、拟杆菌属、...
一、RT-PCR操作步骤 1. RNA抽提 方法:TRlzol法。 主要成分:苯酚(具有裂解细胞和变性蛋白的作用)。 RNA抽提前准备:试剂耗材准备(注意RNase free)、样品的准备。 步骤:样品+1ml TRlzol室温裂解10min+200μL氯仿振荡30s后室温静置2-3 min;4℃低温离心(12 000g×20min);400μL上层水相+600μL异丙醇室温沉淀10...
三、实时定量RT-PCR的实验方法 实时定量RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chn Reaction)是一种能够准确、快速地测定特定RNA分子在样品中表达水平的技术。它结合了反转录(RT)和聚合酶链式反应(PCR)的优点,通过实时监测PCR过程中荧光信号的变化,实现对RNA分子表达量的精确测定。实时定量RT-PCR广泛应用于基因表达分...
(2) PCR 扩增：同常规 PCR，并设置荧光检测步骤。(3) 荧光检测：通过荧光探针或染料实时监测荧光信号。(4) 数据分析：根据 Ct 值和标准曲线，计算样本中的目标 DNA 或 RNA 浓度。常用两种报告系统：插入式 SYBR Green 测定法和 TaqMan 探针系统。01 SYBR Green SYBR Green 通过插入相邻碱基对与所有双链 DNA ...
RT-qPCR是基于PCR技术的一种定量分析方法。在RT-qPCR中,添加了荧光标记的探针,当探针与特异性DNA或RNA片段退火时,荧光信号将显著增加。这个信号可以被探测器捕获并用于定量分析。在每个PCR循环中,荧光信号的增加与产物量的增加相关,因此可以通过监测荧光信号的变化来实时监测PCR产物的扩增。