cDNA 的合成首先在逆转录缓冲液中进行,然后取出1/10的反应产物进行 PCR。 而一步法RT-PCR 具有其它优点(表2), cDNA 合成和扩增反应在同一管中进行, 不需要打开管盖和转移, 有助于减少污染。还可以得到更高的灵敏度, 最低可以达到0.1pg 总RNA,因为整个cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法RT-PCR, 一般使用...
SYBR Green是双链 DNA 结合染料,在 PCR 反应体系中,Sybr 荧光染料特异性地掺入DNA 双链与双链 DNA 结合后,发射荧光信号,而不掺入双链中的 Sybr 染料分子不发射任何荧光信号。从而保证与 PCR 产物的增加完全同步。 优点: 1、对 DNA 模板没有选择性; 2、使用方便,无需复杂的探针设计 3、成本较低使用方便 ...
SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统的出色灵敏度有利于低丰度靶标的检测(图2);即使 RNA 起始量非常有限,也能进行一步法 RT-PCR 扩增。 图2.从低起始量 RNA 样本中进行靶标检测。使用SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统将 1 μg UHRR 连续稀释至 0.01 pg,从中扩增 0.43...
因为我们的目的是PCR出目的基因,因此并不要求材料100%的纯净,只要引物正确,反应条件合适一般能克隆出目的基因。 例如:从猪肝脏中提取总RNA(本人实验经验): 采用Trizol试剂从新鲜猪肝脏组织中提取总RNA。将液氮冻存的新鲜猪肝脏组织约50mg放入EP管中,用研磨杵迅速研磨,然后加入1mL Trizol试剂室温裂解5min。然后10000r...
做RT-PCR用两步法即先抽RNA经反转录再做PCR一般要用到1ug的总RNA。(1ug经反转录成20ul体系后一般可做至少50次20ul体系的PCR)常规做WB一个孔道上样要10*5个细胞。但也和你的目的蛋白及提取的方式有关。如果是膜蛋白或是某细胞器内分布的蛋白细胞数得增多。你最好和你们实验室做过相关实验的人讨论一下。
样本:新冠病毒核糖核酸基因组标准物质(编号:GBW(E)091099)购自中国计量院,其为纯化后的人源核糖核酸基因组,ORF1ab、N和E基因拷贝数浓度分别为6.89×105、1.36×106、8.04×105拷贝/mL(数字PCR定值)。 仪器:ABI 7500实时荧光PCR仪。 方法:将标准物质(以ORF1ab基因浓度为准)2倍倍比稀释,参考试剂盒最低检测限...
一、RT-PCR操作步骤 1. RNA抽提 方法:TRlzol法。 主要成分:苯酚(具有裂解细胞和变性蛋白的作用)。 RNA抽提前准备:试剂耗材准备(注意RNase free)、样品的准备。 步骤:样品+1ml TRlzol室温裂解10min+200μL氯仿振荡30s后室温静置2-3 min;4℃低温离心(12 000g×20min);400μL上层水相+600μL异丙醇室温沉淀10...