异常的扩增曲线包括Ct值偏大、无平台期、平台期下降等问题。 1.Ct值偏大(如Ct值>30) 1)模板量低或基因表达丰度低,建议增加模板量观察Ct值能否成相应倍数减少。 2)qPCR整个反应条件不适宜或引物设计不当导致扩增效率低,建议通过标...
当扩增效率 E 应在 90～110% 之间(根据E=10-1/斜率–1 公式计算,对应的斜率范围应在 -3.1~-3.58之间),标准曲线 R2≥0.98 时,引物的扩增效率才合格。若不在正常范围内,Ct 值偏大很有可能是引物扩增效率低导致。建议重新设计引物,筛选出扩增效率最接近 1...
再以cDNA为模板进行荧光定量PCR，在PCR扩增过程中，通过收集荧光信号，对PCR进程进行实时检测。在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，以此对模板进行定量。在实时PCR扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。那么首先我们来看几个基本概念：基线，荧光阈值和Ct值。基线（basel...
PCR中模板太多或太少都会导致反应失败和qPCR扩增曲线看起来异常。图11.3A显示了含有10倍连续稀释的人工合成寡核苷酸模板的反应。较下部的稀释物太浓,不足以使反应有效或让仪器有效处理基线数据(图11.3B),导致扩增曲线异常和数据不可靠。 图11.3.A)用特异性引物和FAM标记的探针扩增10倍连续稀释的人工模板。浓缩样品的...
另外还有阈值也是影响数据重复性好坏的一个重要因素,阈值的最佳位置应为曲线重复性最好的指数增长区,当发现阈值线偏离指数期以外时可进行手动调节,可是数据的重复性恢复正常。 3、ROX加量有误 ROX的浓度是固定的,不参与PCR扩增,其信号强度只与Mix用量有关,其功能是校准物理误差,例如耗材质量(如管盖厚度、透光性等...
1 加样误差比较大；2 复孔最好三个以上；3 部分引物需要重新设计。看溶解曲线最后的那个峰值，尽管你...
一. RT-qPCR 基本原理和概念实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 以cDNA 为模板进行 PCR,在 PCR 扩增过程中,通过收集荧光信号,对 PCR进程进行实时...
如果引物二聚体存在则阴性对照会出现抬头现象，这在Real-Time PCR中很难避免；若是阴性对照的溶解曲线出现和样品中同样的峰，说明体系配置中存在污染，则实验结果不可用。想了解更多精彩内容，快来关注核酸检测试剂盒邦景 在溶解曲线中出现双峰有三种可能：1、引物峰，引物峰通常是两峰中的前面一个，消除的办法是...
1. 荧光RT-PCR正常放大曲线 随着实验的进行,扩增产物不断积累,荧光信号也相应增加。 每1个循环采集荧光信号,经过一定的循环数(例如40个循环)后,得到以下放大图。 横轴表示放大的循环数cycle,纵轴表示荧光的强度。 这还需要阐明以下基本概念。 基线:指在PCR放大反应的前几个循环中,荧光信号变化不大。 接近一直线,...