1. Total RNA was extracted using a Trizol reagent (Invitrogen). RNA (2 μg) was converted into cDNA using the RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo). QRT-PCR was accomplished using the FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) (Roche) in the ABI PRISM® 7300 real-time PCR...
RT-PCR提取的RNA主要是rRNA,即核糖体RNA,但很少有人用它做些什么,倒是含量较少的mRNA,即信使RNA是中心法则所述的遗传信息表现的中转站,所以我们要把微量的信使RNA弄出来,更重要的是,RNA太容易分解了,环境中无处不在的RNA酶,以及其容易被水解的特点啊,我们不得不尽快把珍贵的信使RNA转化成稳定的形式,于是就有...
PCR reaction for DARC 刘小丰 引物溶解:引物到手后可以先-20°C冻存,取用时,先室温放置5分钟,融化,接着高速离心,如12000rpm,10分钟。之后根据说明书放入一定量的TE buffer,振荡混匀。 一、PCR反应:(25ul反应体系) 每管内容:加样顺序及方法: ①. 1只Eppendorf管,依次加入: MQ水: 17.5ul MQ水:17.5ul×...
3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。生物科研www.biom.cn 二、实验耗材与试剂 1．RNA提取" target="_blank" >RNA取试剂 2...
首先,在反转录酶作用下将RNA(mRNA)反转录成cDNA,以该cDNA第一链为模板进行PCR扩增,根据靶基因设计用于PCR扩增的基因特异的上下游引物,基因特异的上游引物与cDNA第一链退火,在Taq DNA聚合酶作用下合成cDNA第二链。再以cDNA第一链和第二链为模板,用基因特异的上下游引物PCR扩增获得大量的cDNA。反应原理图如下。
建议每20μl反应体系使用0.5μgoligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dT)那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP可以同与mRNA3...
逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)可以:(1)分析基因的转录产物;(2)获取目的基因;(3)合成cDNA探针;(4)构建RNA高效转录系统。 实验原理: 逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作...
primescript rt reagent kit with gDNA Eraser(perfect real time)说明
逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR) 的原理是:提取组织或细胞中的总 RNA,以其中的 mRNA 作为模板,采用 Oligo(dT) 或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以 c…