RT-PCR反应体系详解 PCR反应需要以双链DNA作为模板,因此最初的PCR反应用于检测目标样本的基因组中是否存在特定的目的片段,但是这种以基因组DNA为模板的PCR反应无法检测目的基因是否在样本中表达,此外由于真核生物的基因中存在内含子,直接通过基因组DNA进行PCR也很难确定样本中是否存在目的基因,针对这一问题,发展出了逆...
用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP可以同与mRNA3'最末端退火的扩增引物序列相同,或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。对于部分扩增对象,为了成功进行RT-PCR,需要设计多于一个反义引物,因为目的RNA的二级结构可能会阻止引物结合。建议在...
解:A、由题干信息“RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的多聚酶链式反应(PCR)相结合的技术”分析可知,RT-PCR以RNA为模板来合成DNA,故该体系应含有反转录酶,A正确; B、该体系是通过控制温度使反应在体外反复进行,不需要ATP提供能量,无需加入ATP,B错误; C、PCR操作中,当温度上升到90℃以上时,双链DNA解旋为...
对于部分扩增对象,为了成功进行RT-PCR,需要设计多于一个反义引物,因为目的RNA的二级结构可能会阻止引物结合。建议在20μl的第一链合成反应体系中使用1pmol 反义GSP。 2. 提高逆转录保温温度: 为了充分利用GSP特异性的全部优点,应该使用有较高热稳定性的逆转录酶。热稳定逆转录酶可以在较高温度保温以增加反应严谨性...
因为其较高的特异性,oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。Thermo RT-PCR System提供了oligo(dT)20,因为其热稳定性较好,适用于较高的保温温度。
一般25UL反应体系中,需500ng或1ug的量,如按照1ug计算: (1)总RNA浓度一定要知道:可通过测吸光度来计算,1OD=40ug,公式如下: 总RNA浓度=OD值*40ug*稀释倍数/1000 (ug/uL) (2)所需RNA模板量为=1/总RNA浓度 (uL) 这样水的量就自然定了。
RT-PCR反应体系的灵敏度提高方法: 1、分离高质量RNA 成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂如EDTA或SDS等,以及尽可能减少基因组DNA污染。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的大值。 2、促进逆转录的添加剂 ...
RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction),也称为逆转录PCR,是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。提高RT-PCR反应体系的灵敏度几个方法: 1、分离高质量RNA 成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA应保-证全长并且不含逆转录酶的抑制剂如EDTA或SDS等,以及尽可能减少...
如何提高RT-PCR反应体系的灵敏度: 1、分离高质量RNA 成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA应保证全长并且不 含逆转录酶的抑制剂如EDTA或SDS等,以及尽可能减少基因组DNA污 染。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的大值。 2、使用无RNaseH活性的逆转录酶 ...
12.本技术偶然发现在采用mmlv反转录酶的rt-pcr反应体系中加入终浓度为0.1~0.3 μg/μl的carrier rna,可大幅度降低mmlv反转录酶的室温下的非特异性反应,降低了rt-pcr反应体系在pcr扩增时的ct值,使得采用mmlv反转录酶的rt-pcr反应体系在室温下放置2小时后其ct值的增大数值仍在0~0.5之内。