RT-PCR其操作方法分为两种,即一步法和两步法。一步法RT-PCR,逆转录同PCR扩增结合在一起,即cDNA合成与PCR扩增反应在同一管Buffer及酶中进行,一步完成。两步法RT-PCR,RNA首先在反转录酶的作用下生成cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增,分成两步进行。 ▲图1. 一步法...
1. 反应总体积根据实际情况进行调控,可以做20~50µl 以节约试剂; 2. 将上表各成分加入到0.2ml 或0.5ml 灭菌的PCR 薄壁管中; 3. 如果不用PCR 仪的加热盖,在反应混合液的上层加30 ~ 50µl 的矿物油防止样品在 PCR的过程中蒸发; 二、按以下条件进行反应 Step Temperature,° C Time,min Number of ...
如果PCR反应存在非特异性扩增或污染,则可能会导致多个熔解峰或模糊的熔解峰(图2.3,来源:QPCR-如何判断引物设计是否有问题),此时通常要重新设计引物。 图2.3 熔解曲线多峰 4)Tm值:一般正常qPCR产物,大小在100-300bp之间,熔解曲线Tm大多在80℃以上,若Tm<80℃,有可能出现引物二聚体。 如若反复排除仍无法找到原因,...
在qPCR实验中,实验对照通常有NTC对照和NRT对照。 ●NTC:无模板对照,用来验证实验材料是否被污染或是否存在引物二聚体,一般用水做模板。 ●NRT:采用未经反转录的RNA做模板,以检测gDNA的残留情况。 2 如何选择内参基因? 在进行相对定量PCR实验时,需要选择合适的内参基因对不同样本的基因表达水平进行校正。 常用的内参...
WB实验中,提蛋白时抑制剂究竟要怎么加?需要注意什么?一定是要加的么?#WB#样品制备#科研#实验 210 -- 0:35 App 如何提高RT-PCR反应的灵敏度与特异性?给你6点建议#PCR#科研实验 133 -- 0:25 App 合成的引物进行PCR反应时无目的带的原因有哪些?#PCR 217 -- 0:19 App 避免RNA降解的方法有哪些?简单来...
在进行RT-PCR之前,我们需要设计拟分析基因的引物,如何设计呢?首先我们需要找到该基因的编码序列CDS(Coding sequence)。这里我们以血红素加氧酶HO-1基因为例,在PubMed中的Gene数据库中进行查找。 点击Search, 进入下级界面,找到正确种属,这里以human为例
设计引物时尽量避免出现4个或超过4个G碱基。 实验阴性对照 🧪 反转录阴性对照应包括在所有的RT-PCR实验中,用于检测DNA是否污染(如基因组DNA或PCR产物)。该对照所指不加反转录酶,通过反转录过程得到cDNA再进行荧光定量PCR检测。如检测到扩增,则样本中可能含有基因组DNA污染。
cDNA 的合成首先在逆转录缓冲液中进行,然后取出1/10的反应产物进行 PCR。 而一步法RT-PCR 具有其它优点(表2), cDNA 合成和扩增反应在同一管中进行, 不需要打开管盖和转移, 有助于减少污染。还可以得到更高的灵敏度, 最低可以达到0.1pg 总RNA,因为整个cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法RT-PCR, 一般使用...
qRT-PCR实验流程:提取组织/细胞总RNA,以其中的mRNA为模板,利用逆转录酶反转录成cDNA,再进行PCR扩增,通过计算2^-ΔΔct值获得基因表达量。 首先,计算每组内参基因sgAction Ct均值 然后,计算第一个 Δct,即每组的待检目的基因减去内参基因的 Ct 值 接着,计算对照CK组中 Δct 的均值,再用处理组的 每一个Δct...