在Huang J等人的研究中,出现转录组和qPCR结果的不一样(甚至趋势相反的情况),文章也对这种情况进行了探讨[2]。 因此在这里小派总结了几个可能影响转录组和qPCR一致性的原因: 1 样本是否为同一批次: 因为RNA的表达具有时空特异性,不同批次处理的样本之间本身可能存在一定的差异,所以做qPCR验证的时候建议是直接用转录...
在真核生物中,基因可能通过不同的剪切形式产生多条转录本,而各转录本的差异变化趋势也可能是不一致的,因此我们需要明确我们做qPCR是针对基因还是针对特定的转录本去验证。常规转录组分析是针对于整个基因定量的,因此可以针对多个转录本共有的外显子去设计引物,从而验证基因的表达;如果是对特定转录本分析的话,可能需要...
1. 用于qPCR定量检测的基因,虽然差异分析时的差异倍数高,但是本身表达量偏低,导致qPCR定量检测时CT值较高,误差较大;挑选的基因差异倍数较低或者FDR值较高,差异不显著。 2. qPCR验证和测序的样品是否相同?RNA的表达具有时空特异性,同一批次的不同样本的mRNA表达也可能出现差异。 4. 用于qPCR验证的样本量是否覆盖测...
总体来说,基因的本身特征如基因长度,GC含量等,RNA-seq的建库方式以及基因表达量算法均会影响基因的表达量计算,使计算出的表达量与实际有所出入,从而与qPCR的定量结果之间存在差异。如若二者结果出现相反,也在情理之中。这也是任何一个技术获得结果之后需要多方验证的原因之一。 参考文献 [1] Bias detection and corre...
虽然传统上使用内参基因进行qPCR归一化是验证RNA-seq数据的标准方法，但在特定情况下，没有内参基因也可以...
一般需要验证基因的数目:20个左右 在验证时,往往会出现RNA-Seq测序结果和QPCR结果不一致的情况,遇到此类情况,因为这是正常现象(活久见)。 一个事实,我们看到的很多SCI都有验证实验部分,并且文章中的结果居然都是很好!很多同学心里更加捉急,为嘛我的结果不符合预期,为嘛我的结果这么挫?!
如果qPCR 验证的结果与RNAseq的结果不一致，需要从qRT实验和RNAseq数据两方面同时考虑。在qRT实验方面，考虑的因素有：1. 反转录cDNA的时候是用的Ransom primer还是OligodT, 是否和RNAseq反转录的方法一致。2. 引物跨内含子设计。3. RNA引物设计的特异性。引物质量的好坏可以从融解曲线来判断。当融解曲线只有一个峰...
做完RNA-Seq测序之后,往往会用QPCR来验证一下结果。 因为RNA-Seq测序数据得到的结果作为定量参考,参数的改变也会造成结果的不同。所以需要进行qPCR验证,表达水平的结果最终以实时定量PCR为准。 一般需要验证基因的数目:20个左右 在验证时,往往会出现RNA-Seq测序结果和QPCR结果不一致的情况,遇到此类情况,因为这是正常...
一般需要验证基因的数目：20个左右 在验证时，往往会出现RNA-Seq测序结果和QPCR结果不一致的情况，遇到此类情况，因为这是正常现象（活久见）。原因可以查看我们之前的微信分享的文章（戳这里）。一个事实，我们看到的很多SCI都有验证实验部分，并且文章中的结果居然都是很好！很多同学心里更加捉急，为嘛我的...
RNA-Seq结果中的RT-qPCR验证。 研究小结 本研究首次在松材线虫(PWN)全基因组范围内绘制了DNA甲基化水平的分布情况,证实了线虫在四个发育阶段中均存在DNA甲基化。在扩散性JIII阶段与繁殖性阶段之间,甲基化存在显著差异,表明DNA甲基化可能在JIII阶段抗不利环境条件中发挥潜在作用。研究还支持DNA甲基化在JIII形成过程...