拿到RNAseq的结果后,首先要做的是对RNAseq的结果进行qPCR验证。如果qPCR 验证的结果与RNAseq的结果不一致,需要从qRT实验和RNAseq数据两方面同时考虑。 在qRT实验方面,考虑的因素有: 1. 反转录cDNA的时候是用的Ransom primer还是OligodT, 是否和RNAseq反转录的方法一致。 2. 引物跨内含子设计。 3. RNA引物设计的...
通过RNA-seq,发现目标基因在处理组与对照组之间显著差异表达,与试验预期结论一致。于是很开心地通过qPCR进行进一步的验证,结果却傻眼了,qPCR并未显示出基因表达在两组间存在差异? 或者反过来的情形,已经通过qPCR检测到目标基因在处理组与对照组之间的表达水平存在很大差异,但是却发现RNA-seq的基因表达定量并无明显区别,...
如果qPCR 验证的结果与RNAseq的结果不一致,需要从qRT实验和RNAseq数据两方面同时考虑。在qRT实验方面,考虑的因素有:1. 反转录cDNA的时候是用的Ransom primer还是OligodT, 是否和RNAseq反转录的方法一致。2. 引物跨内含子设计。3. RNA引物设计的特异性。引物质量的好坏可以从融解曲线来判断。当融解曲线只有一个峰...
类似地,如果RNA-seq获得了基因表达的差异,而qPCR没有检测到差异,可能恰好设计的qPCR引物扩增了一段无明显表达变化的外显子区域中。这种情况下,也可以使用IGV等基因组浏览器查看测序序列和基因组比对的BAM文件,找到该基因中变化明显的外显子区域,然后针对该区域的序列重新设计qPCR引物,应该就能检测到显著的区别了。
1)首先是数据的准备。很多老师的实验设计比较复杂,可能是多个品系,每个品系多个时间点,再加上RNA-seq和qpcr的数据,要呈现在一张图形上的话看似比较复杂,其实也很简单。关键就在数据准备。以两品系+三时间点为例,如下图所示,数据的关键在于中间的空格。(是不是很简单啊) 然后,全选数据,选择折线图,...
(3)花色苷合成相关差异基因 qPCR 分析 基于基因表达量(FPKM>10)和其与花色苷含量的相关性(|r|>0.85),筛选了3个R2R3-MYB基因(FaMYB82、FaMYB6和FaMYB90)和9个差异结构基因(FaPAL、Fa4CL-1、Fa4CL-2、FaF3H-1、FaF3H-2、FaDFR、FaANS、Fa3...
通过RNA-seq,发现目标基因在处理组与对照组之间显著差异表达,与试验预期结论一致。于是很开心地通过qPCR进行进一步的验证,结果却傻眼了,qPCR并未显示出基因表达在两组间存在差异? 或者反过来的情形,已经通过qPCR检测到目标基因在处理组与对照组之间的表达水平存在很大差异,但是却发现RNA-seq的基因表达定量并无明显区别,...
1)首先是数据的准备。很多老师的实验设计比较复杂,可能是多个品系,每个品系多个时间点,再加上RNA-seq和qpcr的数据,要呈现在一张图形上的话看似比较复杂,其实也很简单。关键就在数据准备。以两品系+三时间点为例,如下图所示,数据的关键在于中间的空格。(是不是很简单啊)然后,全选数据,选择折线图,如图所示: ...
总体来说,基因的本身特征如基因长度,GC含量等,RNA-seq的建库方式以及基因表达量算法均会影响基因的表达量计算,使计算出的表达量与实际有所出入,从而与qPCR的定量结果之间存在差异。如若二者结果出现相反,也在情理之中。这也是任何一个技术获得结果之后需要多方验证的原因之一。
反过来想,qPCR实验有误差吗?什么您说没有误差?那一定是没动手做过实验。两个都有误差的东西,不一致...