在Huang J等人的研究中,出现转录组和qPCR结果的不一样(甚至趋势相反的情况),文章也对这种情况进行了探讨[2]。 因此在这里小派总结了几个可能影响转录组和qPCR一致性的原因: 1 样本是否为同一批次: 因为RNA的表达具有时空特异性,不同批次处理的样本之间本身可能存在一定的差异,所以做qPCR验证的时候建议是直接用转录...
在Huang J等人的研究中,出现转录组和qPCR结果的不一样(甚至趋势相反的情况),文章也对这种情况进行了探讨[2]。 因此在这里小派总结了几个可能影响转录组和qPCR一致性的原因: 1、样本是否为同一批次: 因为RNA的表达具有时空特异性,不同批次处理的样本之间本身可能存在一定的差异,所以做qPCR验证的时候建议是直接用转录...
3. MeRIP-qPCR 用以对目标基因上的某个修饰位点(以一小段区域的形式,MeRIP法精确不到单碱基)的修饰水平进行验证。其原理同MeRIP-seq测序中MeRIP实验相同,实验基本操作也一致:对RNA进行片段化,然后将片段化后的RNA样品分为二部分:一部分用于免疫共沉淀实验(IP)后作为IP样品,另一部分不进行IP直接作为Input样品。之...
如果qPCR 验证的结果与RNAseq的结果不一致，需要从qRT实验和RNAseq数据两方面同时考虑。在qRT实验方面，考虑的因素有：1. 反转录cDNA的时候是用的Ransom primer还是OligodT, 是否和RNAseq反转录的方法一致。2. 引物跨内含子设计。3. RNA引物设计的特异性。引物质量的好坏可以从融解曲线来判断。当融解曲线只有一个峰...
总体来说,基因的本身特征如基因长度,GC含量等,RNA-seq的建库方式以及基因表达量算法均会影响基因的表达量计算,使计算出的表达量与实际有所出入,从而与qPCR的定量结果之间存在差异。如若二者结果出现相反,也在情理之中。这也是任何一个技术获得结果之后需要多方验证的原因之一。
因为RNA-Seq测序数据得到的结果作为定量参考,参数的改变也会造成结果的不同。所以需要进行qPCR验证,表达水平的结果最终以实时定量PCR为准。 一般需要验证基因的数目:20个左右 在验证时,往往会出现RNA-Seq测序结果和QPCR结果不一致的情况,遇到此类情况,因为这是正常现象(活久见)。
拿到RNAseq的结果后,首先要做的是对RNAseq的结果进行qPCR验证。如果qPCR 验证的结果与RNAseq的结果不一致,需要从qRT实验和RNAseq数据两方面同时考虑。 在qRT实验方面,考虑的因素有: 1.反转录cDNA的时候是用的Ransom primer还是OligodT, 是否和RNAseq反转录的方法一致。 2. 引物跨内含子设计。 3. RNA引物设计的...
做完RNA-Seq测序之后,往往会用QPCR来验证一下结果。 因为RNA-Seq测序数据得到的结果作为定量参考,参数的改变也会造成结果的不同。所以需要进行qPCR验证,表达水平的结果最终以实时定量PCR为准。 一般需要验证基因的数目:20个左右 在验证时,往往会出现RNA-Seq测序结果和QPCR结果不一致的情况,遇到此类情况,因为这是正常...
RNA-seq是一种非常可靠的方法,能够全面评估转录水平的变化。已经有无数文献证明了RNA-seq结果与传统方法的高度相关性。然而,过去人们总是用传统的qPCR方法去验证RNA-seq的结果,这似乎理所当然。早期,RNA-seq的上一代产品micro-array的结果并不总是可靠,因此需要进行验证。然而,现在RNA-seq已经成为一种久经考验的方...
如上图,大部分RNA-seq类项目,老师都会看到测序的饱和曲线达到平台期。也就是说再增加测序量,新检测出的基因数并不会有明显增加。 第二个问题“转录本表达量的高低变化”比“转录本的有无”更具有普遍的生物学意义。虽然个别基因的表达量变化程度,可以使用Qpcr来验证。但我们往往也使用所有差异基因来统计某些规律。