RNA-seq是一款可用于研究和/或定量两个或多个条件下基因表达的实验技术。 众所周知,基因可以给蛋白质的合成提供指导,而蛋白质会在细胞中发挥一定的作用。尽管所有的细胞都包含相同的DNA序列,肌肉细胞同神经细胞以及其他类型的细胞还是不同的,原因在于在这些细胞中被开放(turned on)的基因不同,产生的RNA和蛋白质也...
我们一般的RNA-seq要测的,也是mRNA的各种变化,所以在实验过程当中,我们一般要把核糖体RNA先去掉。然后再进行建库测序。 去除核糖体RNA,并进行建库的方法,有许多种。我们主要介绍一下应用最广泛的illumina公司的TruseqRNA建库方法。 下图是mRNA测序的建库过程图。首先是利用高等生物的mRNA都有Poly(A)尾巴这个特点,用带...
测序得到的原始数据我们称之为 Raw reads,之后我们会根据 10X Genomics单细胞RNA Seq独特的文库结构,对 Reads 的 Barcode 、UMI 和插入片段部分进行拆分,之后插入片段部分将比对到参考基因组,然后统计比对到各个区域的比例,并进行表达量统计;基于表达量的结果, 进行细胞时间轨迹预测,细胞聚类等分析,基于差异表达的结果...
RNA测序(RNA-seq)逐渐应用于多个层面的研究,比如单细胞基因表达、RNA翻译、RNA结构组和分析差异基因(differential gene expression,DGE)等。主要的RNA-Seq方法有:转录组测序、小RNA/非编码RNA测序等。 图2 中心法则中RNA分类示意图[2] 转录组测序 转录组:即某个物种...
瞒不住了!高通量单细胞RNA-Seq,长读长的那种! 在有些研究场景下,长读长测序(long-read sequencing)方法相比传统的短读长测序(short-read sequencing)方法,会是一个更好的选择。长读长测序文库构建操作相对简便。需要多次重复构建文库时,长读长测序也不需面对短读长测序那样复杂繁琐的操作流程。此外,长读长测序...
图3 | Illumina技术原理示意图 第三代测序技术（Long Read RNA-seq）由于Illumina测序前需要事先将样本链打碎，测序后通过软件去还原完整的序列，而且单次读长限制在200bp以内，在做全转录组分析时可能会丢失相当一部分信息，而第三代测序技术恰恰弥补了这一短板。第三代技术有两种：1）单分子实时测序技术（Single...
图4 翻译组分析两种方法 多聚核糖体分析利用蔗糖梯度离心将结合多个核糖体、1个核糖体和无核糖的mRNA分离。与多个核糖体结合的mRNA被默认为翻译活跃的mRNA。当然,该方法也有所改进,比如利用非线性密度的蔗糖进行梯度离心、利用Smart-seq建库方法将所需mRNA降低至10ng、高分辨...
从而富集成熟的编码 mRNA,为 mRNA-Seq 工作流程提供基础。在此过程中,首先对 RNA 进行变性以去除二级结构并使 poly(A) 尾与磁珠表面上修饰的Oligo(dT) 分子杂交。杂交后,除去无聚腺苷酸化的RNA。磁珠清洗,然后通过提高温度实现mRNA的洗脱(图 2)。 图1 | poly(A) RNA 分选示意图。
图1 RNA-Seq筛选到的乙烯生物合成和信号转导相关差异基因相对表达的热图(Li et al., 2022)。 1.2 ATAC-seq ATAC-Seq技术是一种研究表观遗传的创新型技术,它是一种在全基因组水平上通过高度活跃的Tn5转座酶切割DNA序列来检测染色质可及性的方法。通俗地讲,就是Tn5转座酶可以随机结合并切割染色质开放区的DNA,...
图1. 靶向RNAseq实验流程图 通过对多个细胞系进行检测分析,靶向RNA-seq方法在检测融合基因上更有优势,例如EWSR1-FLI1。同时在两例肺癌患者肿瘤组织中发现,靶向RNA-seq不仅能够确认ROS1和ALK的重组现象,同时能够确定其伴侣基因以及融合连接位点 (图 2)。提高融合基因检测率,并且与之前的诊断具有高度一致性。