· 对照:一般选用Input作为阳性对照;此外,可以设置样本对照(例如,处理前vs处理后)。 · 抗体!抗体!抗体!:首选ChIP级别抗体,至少IP级别;若没有IP级别抗体,也可选择标签抗体(要确保标签和蛋白成功融合表达)。 2.具体步骤 主要步骤包括紫外交联、准备裂解产物、准备免疫沉淀的磁珠、免疫沉淀 RNA连接的蛋白-RNA 复合物...
(5)互作蛋白筛选和验证:数据分析以信号强度作为强阳筛选,以文献查阅,功能匹配,批量RIP-qPCR验证,提高验证成功率。 一、RIP-Seq(InPut组 vs 目的抗体IP组)15000 1.RIP-Seq(宋细胞样本制备) 70% 10500 2.RIP-Seq(宋架直5K的稳转细胞株制备) 15000 3.RIP-Seq(宋架直10K的5个RIP-qPCR验证) 15000 4.RIP-Se...
1.制备蛋白酶K缓冲液。每个免疫沉淀需要150 µL蛋白酶K缓冲液,包含117 µL RIP洗涤缓冲液,15 µL 10% SDS,18 µL 10 mg/mL蛋白酶K。 2.在150µL的蛋白酶K缓冲液中重新悬浮第三节第8步中的每个免疫沉淀。 3.将第三节第4步的input样品解冻,在试管中加入107 µL RIP洗涤缓冲液、15 µL ...
RNA片段化后,在进行免疫沉淀前,需要取一部分做Input对照(不进行免疫沉淀过程)。Input是断裂后的RNA,需要与沉淀后的样品RNA一起经过逆转交联,RNA纯化, 以及最后的PCR或其他方法检测。通过后续数据分析,我们可以通过Input对照排除背景噪音(非特异性结合所造成的假阳性Peaks), 验证RNA断裂的效果和整个实验中IP效果,所以In...
如果目的蛋白在样品中有表达、抗体效果较好,在样品中可以检测到目的蛋白,Input在对应位置产生条带; 如果使用的抗体能有效富集目的蛋白,那么IP也会在对应位置产生条带;此外还会出现抗体的条带,这是由于抗体与蛋白紧密结合,上样前无法分离,WB质检时加入的酶标二抗结合抗体重链(或轻链)在55kD(或25kD)出现条带。
2. 阴性对照:分为mock和input两种,二者均能起到减少假阳性的作用。mock:用普通IgG为抗体,理论上不会ChIP下来任何DNA片段,因此作为阴性对照。 IgG不需要进行测序,只是判断IP试验中所选取的抗体是否特异。Input是DNA或者RNA片段化后,在进行免疫沉淀前取出一部分断裂后的染色质做input对照(不进行免疫沉淀过程)。Input是...
1.如果目的蛋白在样品中有表达、抗体效果较好,在样品中可以检测到目的蛋白,Input在对应位置产生条带; 2.如果使用的抗体能有效富集目的蛋白,那么IP也会在对应位置产生条带;此外还会出现抗体的条带,这是由于抗体与蛋白紧密结合,上样前无法分离,WB质检时加入的酶标二抗结合抗体重链(或轻链)在55kD(或25kD)出现条带。
自行送IP产物 IP后产物,不需要公司去除rRNA,不需要公司打断片段 IP 产物/Input样本送样量:单次建库大于20 ng,浓度大于1 ng/μl,插入片段大小分布建议在250-300 bp。 建议客户在IP过程中自行去除rRNA,且IP后产物插入片段建议分布在250-300bp,诺禾致源接收样品后会检测样品的总量和纯度,以诺禾致源检测结果为准...
·对照:一般选用Input作为阳性对照;此外,可以设置样本对照(例如,处理前vs处理后)。 ·抗体!抗体!抗体!:首选ChIP级别抗体,至少IP级别;若没有IP级别抗体,也可选择标签抗体(要确保标签和蛋白成功融合表达)。 ▼▼▼ 2.具体步骤 主要步骤包括紫外交联、准备裂解产物、准备免疫沉淀的磁珠、免疫沉淀 RNA连接的蛋白-RNA ...
4. 结果提供SCI标准Figure,可直接用于文章 客户提供 1. 目的蛋白抗体(可用于IP)及其说明书 2. 需检测的细胞样品 3. 目的基因、目的蛋白信息 赛诚提供 1. 原始数据、结果图片(包括Input、阳性及阴性对照结果) 2. 标准实验报告(包括详细的材料与方法) 3. SCI标准Result Figure©...