实时荧光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time qPCR) 由美国Applied Biosystems公司在1986年首先推出,所谓Real-time qPCR是指在PCR反应中加入荧光基团,通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化,即时分析目的基因的初始量,该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。Real-time ...
real time PCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统,也叫实时定量基因扩增荧光检测系统,简称QPCR。 原理 1 实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准...
在PCR中,这些序列被称为引物,是单链DNA的短片段(大约15 ~ 30个碱基)。在设计PCR实验时,研究人员要确定要扩增的DNA区域,并设计一对引物,一个在正向链上,一个在反向链上,专门针对目标区域的侧翼。 引物设计是PCR实验的一个关键部分,应谨慎进行。引物序列的选择必须以感兴趣的独特DNA为目标,避免与类似序列结合的...
自90年代Taqman探针诞生以来,虽然荧光探针(引物)不断有新的技术出现,但是作为一种经典的定量PCR技术,Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选,这主要是因为相对于SYBR荧光染料,Taqman探针具有序列特异性,只结合到互补区,而且荧光信号与扩增的...
基因特异性(GSP, Gene Specific Primer)引物:GSP引物是根据已知基因序列设计的引物。通常将PCR特异性下游引物作为GSP引物来进行反转录,理论上讲这种引物只和一条基因有结合位点,因此由GSP引物反转录得到的cDNA不适合于复数基因的检出,一般被应用于一步法的RT qPCR反应。
1)随机六聚体引物: 当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时,可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时,体系中所有RNA分子全部充当了cDNA*链模板,PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
引物或探针质量下降 尽量避免新合成引物批次间的差异,可以使用原来质量好的引物做为对照。 PCR反应条件、引物浓度、序列等不恰当 扩增效率差的PCR较容易产生重现性差。通过变更引物和探针的浓度或PCR反应条件来进行调整。扩增不好时,一般可降低退火温度或提高引物浓度,也可以延长延伸时间。如模板的GC含量较高,可延长变...
1)随机六聚体引物: 当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时,可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时,体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板,PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
4.引物长度和位置: 引物长度的选择会直接影响PCR产物片段的大小,在设计引物时需要注意引物的长度不宜过长,以免影响PCR效果。此外,引物的位置应选择在目标序列的保守区域内,以确保引物能够与多个目标DNA序列结合。 5.引物配对: 在引物设计中,需要设计两个互补的引物分别结合目标序列的两个互补的片段。这两个引物的长...