1. 在培养板中用PBS液冲洗细胞2次后,加入Trizol裂解细胞,每孔加1ml Trizol(6孔板).用取样器反复抽吸混匀,再加入糖原250ug(5ul,50ug/ul)混匀。注意:Trizol加量根据培养板面积决定,不是由细胞数决定.如果Trizol加量不足,可能导致提取的RNA中有DNA污染。 2. 将样品在15-30℃放置5min,使得核酸蛋白复合物完全...
一 引物的设计引物的设计对于这个实验至关重要,因为real time pcr的检测灵敏度比较高,所以相应的对引物设计的要求就很高。普通的要求规则大家都知道,还有几点必须注意:1,引物的错配率(引物错配形成引物二聚体,但是SYBR照样能嵌入进去,结果导致实验结果的误差很大,
1,引物的错配率(引物错配形成引物二聚体,但是SYBR照样能嵌入进去,结果导致实验结果的误差很大,重复性也不好)。 2,引物的特异性一定要高(不像常规PCR,引物同源性不高,只要两条产物的片段长度相差足够大,在电泳的时候能够区分开就可以。real time PCR只有在熔解曲线的时候能分开,所以这就造成整个实验结果误差很大...
的形式来表示的，负值表示下调，正值表示上调。随后为了验证RNA-seq结果，做了Realtime-PCR进行验证。用...
一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录) 不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法,因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高,所以,正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法,在实验过程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。 在总RNA的提取过程中,注意避免mRNA的断裂;取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测,如果存在DN...
使用Real-Time PCR进行microRNA和非编码 RNA分析 miRNA 谱分析 miRNA定量 miRNA 功能分析 使用实时荧光定量PCR进行Pri-miRNA分析 使用实时荧光定量PCR进行长链非编码RNA (ncRNA) 分析 小RNA分析 使用TaqMan 检测试剂盒进行 miRNA 分析 使用实时荧光定量 PCR 进行 Pre-miRN...
当然可以。real time PCR最终是对PCR的模板做定量，只是现在较多用于基因表达差异比较与分析，也就是mRNA的定量（RT-qPCR），所以给生手的影响是用于RNA。但要注意的是，即使是mRNA,也有逆转录的过程，也就是先逆转录cDNA，这才是rt-pcr真正意义的模板，分析的是cDNA的量，进而反应mRNA的量。直接用DNA...
real time RT-PCR 指的是 qPCR+RT-PCR 的组合,是说将 mRNA 逆转录为 cDNA 后再作为模板进行实时荧光 PCR 分析,因为 RT-PCR 是可以定性的,但不能进行定量检测的。 所以不难理解 real-time RT-PCR(RT-qPCR)就是结合了荧光定量技术的反转录 PCR:先从 RNA 反转录得到cDNA(RT),然后再用 Real-time PCR ...
感觉条带比较暗，还有大量降解。感觉不是太好，不过可以先试一下做RT-PCR 发自小木虫Android客户端 ...
一、细胞RNA的提取 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RNA质量的高低常常影响cDNA库,RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种总RNA抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。 实验所需试剂和材料:Trizol(4℃保存)、无水乙醇、氯仿(三氯甲烷...