1、实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR) Real-time-PCR 和 qPCR 是一码事。实时荧光定量PCR,也叫Real-Time PCR,即二代PCR,是指在PCR扩增反应体系中加入荧光染料或者荧光基团,在整个PCR过程中通过收集荧光信号实时监测每一个循环中扩增产物量的变化,最后通过标准曲线和CT值对待测样品进行定量分析。...
实时聚合酶链式反应(Real-time PCR)引物设计原理主要包括以下几个方面: 1.引物长度和碱基序列选择: 引物通常由20-25个碱基组成,并且应尽量避免区域内存在重复序列或剪切位点。引物的碱基序列应根据靶标基因的DNA序列进行设计,确保与目标DNA序列特异性结合。 2. GC含量和熔解温度选择: 引物的GC含量对于引物的特异性和...
通常将PCR特异性下游引物作为GSP引物来进行反转录,理论上讲这种引物只和一条基因有结合位点,因此由GSP引物反转录得到的cDNA不适合于复数基因的检出,一般被应用于一步法的RT qPCR反应。 讲到引物,我们需要了解一下引物设计的要求。 Real time PCR与普通PCR的实验目的不同,所以对引物的设计要求也不同。普通PCR的实验...
如何用软件设计PCR引物 1.在NCBI核酸序列数据库中获得待设计引物的基因序列（gDNA）及表达序列（CDS序列）2.根据gDNA及CDS序列，明确CDS序列中内含子的确切位置（如果表达载 体构建，则只需要明确编码序列中起始密码子（ATG）与终止密码子 (TAA/TAG/TGA)的位置即可）3.根据Realtime-PCR引物设计原则，用Oligo6.0...
real time PCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统,也叫实时定量基因扩增荧光检测系统,简称QPCR。 原理 1 实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准...
Real-timePCR原理 1.1荧光染料和荧光探针 实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种。非探针类则是利用荧光染料（如SYBR Green I）或者特殊设计的引物(如LUX Primers)来指示扩增的增加。 探针类(TaqMan探针和 分子信标)是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。探针类由于增加了探针的...
real-time rt-pcr的原理 实时反转录聚合酶链式反应(real-time RT-PCR)的原理基于实时荧光定量PCR技术,结合了逆转录(RT)和聚合酶链式反应(PCR)两个技术。 首先,通过逆转录将RNA转录成cDNA。这个过程由逆转录酶和引物完成,引物与目标RNA序列的特异性序列互补。当引物与目标RNA序列结合时,逆转录酶开始参与反应,通过...
1、引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74°C,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2、引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3’端...
实时聚合酶链反应(real-time PCR)是一种广泛应用于分子生物学研究中的技术,用于检测和定量DNA或RNA的存在。与传统聚合酶链反应(PCR)相比,实时PCR能够提供更快、更准确的结果。 实时PCR基于聚合酶链反应原理,通过扩增目标DNA或RNA序列来检测其存在。实时PCR使用一对特异性引物,即前向引物和反向引物,与目标序列的两侧...
反转录引物的选择与Real-TimePCR引物设计的要求 1)随机六聚体引物: 当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时,可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时,体系中所有RNA分子全部充当了cDNA*链模板,PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中...