最简单的方法就是看引物的溶解曲线是不是单峰。如果不是单峰,那么可能引物的特异性不太好,可能会出现非特异性扩增,从而影响实验结果。 引物特异性的解决方法: 更换引物 降低引物浓度 升高退火温度🌡️ 测试引物的扩增效率 📈 取一个样品,做浓度梯度稀释,一般是五六个浓度,然后用特异性引物跑qPCR。最后用CT值...
4、实战演练:QPCR数据分析与作图的完美结合 ①准备数据:整理你的QPCR实验数据,包括Ct值、样本信息、基因信息等。 ②数据处理和标准化:按照前面的方法进行数据处理和标准化。 ③数据可视化:选择合适的图表类型进行作图。比如,对于比较不同基因表达量的任务,可以使用柱状图;对于探究基因与生理指标之间关系的问题,可以使用...
上面的p53和GAPDH都有三个PCR孔,这叫做PCR重复,其作用是为了消除本次实验的操作误差。同样的,我们再重新种细胞,做qPCR实验,如此重复三次,则称为独立重复实验。而我们统计结果的时候需要统计的则是独立重复实验。 实验后,我们得到Ct值结果如下: Test1:...
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两种常用的标准化 ChIP-qPCR 数据方法——Percent Input法和富集倍数法(Fold Enrichmen)。与input相关的ChIP-qPCR数据包括ChIP的背景水平和input染色质的标准化。建议ChIP 实验重复,尽可能将结果与背景信号和标准误差一起显示。 Percent Input法 使用这种方法,从ChIP获得的信号除以从input样本中获得的信号。input样本代表...
原因分析:一般为实验操作问题导致 解决方法:将模板稀释后和上样;准确配置qPCR反应体系,充分混匀;定期校准qPCR仪器 2. NTC出现Ct值 NTC(无模板阴性对照)出现扩增一般会有两种情况: 2.1 NTC与目的基因孔的融解曲线峰不重叠。 原因分析:此情况下一般NTC的Tm值与目的基因的Tm值较低,主要是因为引物二聚体造成。
qPCR实验步骤、结果分析、引物查找方法。不会引物设计也没关系啦 超好用的引物序列查找的几个网站,找到了记得用NCBI blast一下再用哦～ 1. RNA提取 (1)高速离心机预冷,75%乙醇提前配置并预冷,整个提取RNA的过程在冰盒上操作; (2)收集细胞,使用 PBS缓冲液洗两遍,每个样品加入1 mL Trizol裂解液,反复吹打,静置...
结果分析 下图为计算过程,是qPCR计算的核心所在,大部分同学都在此处不知如何计算 △Ct=Ct(p53)-Ct(GAPDH); 这里需要注意的是2^-△△Ct的计算,首先我们把对照里面的2^-△Ct求平均(上图中为0.000780573),然后用2^-△Ct 中的每一个数据除以这个数据,对照组也同样除。
由于qPCR是实时定量检测致病病原体基因核酸，因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到优势。存在问题 样本抑制物的影响 临床样本（如血液、粪便、组织等）和环境样本中可能含有各种抑制物，如血液中的血红蛋白、免疫球蛋白，粪便中的腐殖酸等。这些抑制物可能干扰 PCR 反应，降低酶的活性，从而影响...