ed recombinant GST or MBP fusion proteins bound to glutathione–agarose beads or amylose resin, respectively, were mixed with total protein extracts in 100 mL of protein pull-down buffer (40 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 10 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0.4 M sucrose, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, and 0.2...
会导致蛋白不能充分电泳。蛋白buffer含SDS使蛋白带上负电荷，这样才能屏蔽电荷的影响，在SDS胶中以分子量不同做电泳，导致样品中蛋白不能进行充分的电泳。Pulldown技术的基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），但细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有...
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（8）按100:1的比例加入裂解酶（25ml 细胞悬浮液加25μl 裂解酶），混匀室温放置5min（如裂解物太粘稠，可用10μg/ml DNase处理）。（9）把裂解的细胞悬浮液放入液氮中20s，再将其放入37℃温水中融化，反复10次。（10）12000rpm 离心10min，吸取上清到另一离心管中。（11）吸取部分样品中加入2×上样Buffer...
3.3:考马斯亮蓝染色:取2ug GST-A, HIS-B加适量SDS-loading buffer,100度煮10min,上样进行蛋白电泳; 3.4:电泳结束后,切胶,加入考马斯亮蓝染色液,过夜染色; 3.5:用脱色液进行脱色至无背景。 4、Pull-down 4.1:安装柱子,用PBS平衡柱子(加入使其自然流下); 4.2:加入2 mL GST-A到一个封闭的GST柱子,4℃...
4)破碎后,12000r离心,收集细胞上清,并加入5×Loading buffer,煮10分钟。 5)通过Western blot技术检测蛋白表达效果。 3、蛋白大规模培养及纯化鉴定 经过上述蛋白表达预实验,确定了适宜的IPTG诱导浓度、诱导时间和诱导温度后,可以进行蛋白的大规模培养。 1)收集全部培养上清,如果目标蛋白带有GST标签,可以利用GST成品纯化...
蛋⽩相互作⽤Pull-Down实验 实验原理：Pull-Down技术是通过蛋⽩相互作⽤来研究细胞通路的有⼒⼯具。是确定两种或更多蛋⽩之间相互作⽤的体外⽅法。Pull-Down实验可⽤来检测已知的蛋⽩相互作⽤条件，并且可⽤来筛选未知的蛋⽩相互作⽤。⽤作诱饵的蛋⽩是重组蛋⽩，会含有⼀个⽤于...
e. 吸除上清，加入50ul Elution buffer,重悬磁珠；f. 把样本放置到磁力架上进行磁性分离；g. 转移上清到新的EP管中，即为pull down 产物；h. 向 pull down产物中加入13ul loading buffer,并于沸水中水浴10min。i. 产物进行后续质谱检测 四、技术优势 ✅ 高特异性 ✅ 广泛适用性 ✅ 高灵敏度 ✅ 多...
3、Buffers for SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis): Sample buffer and running buffer which are commonly used in your laboratory. 4、冷冻离心机(Microcentrifuge equipped with a cooling device.) 5、GST融合蛋白(GST-fused protein : GST from Schistosoma japonicum is generall...
7、 pull down试剂盒中的loading buffer颜色很淡,和平时用的不一样,是否正常? 我司pulldown试剂盒的loading buffer 确实偏淡一些。主要考虑loading buffer过多会对核酸的跑胶结果有一定影响,因此能看到条带显示就足够了。 8、 RAP(RNA 反义纯化)与RNA-protein pulldown有哪些异同?