GST-pulldown操作说明 GST Pulldown（研究GST-CDC-48与Rpn11相互作用）1、取两只1.5mL EP管，标记为实验组和对照组，并向每支管中分别加入25μL GST-beeds 20%乙醇充分混合液。2、加入Wash buffer 1 洗涤两次，每次500μL，5000rpm，4℃离心30s去除上清液。Wash buffer 配比如下：Tris-HCL 50 mM NaCL 100...
随后用1×Wash Buffer清洗RNA结合蛋白混合物3次,加入Elution Buffer,37oC洗脱30分钟,用loading buffer变性蛋白,用于后续分析。 4、SDS-PAGE分析及银染 所得RNA结合蛋白混合物用于SDS-PAGE分析,使用Thermo Fisher公司的NuPAGE俐4-12%Bis-Tris Protein Gels预...
PROBE:目的基因启动子区 二.DNA pull down实验 1实验目的:通过生物素标记的探针,在细胞中钓取与启动子区有相互作用的蛋白;并进行质谱鉴定。 2实验材料 l主要试剂 l主要仪器及器材 3实验方法 l链霉素亲和磁珠与生物素标记的DNA结合 1、磁珠准备:使用Wash Buffer I 500µl冲洗磁珠3次。 2、用Wash Buffer I(...
1、磁珠准备:使用Wash Buffer I 500µl冲洗磁珠3次。 2、用Wash Buffer I(配方如表2-3所示)重悬磁珠,然后将其加入到生物素标记并变性的RNA中,4℃过夜。 3、过夜的混合物3000rpm离心1min,去上清。 4、Wash Buffer I冲洗3次。 表2-3 Wash Buffer 配方 l 磁珠复合物与蛋白结合 1、往磁珠-RNA混合物中...
GSTPulldown(研究GST-CDC-48与Rpn11相互作用) 1、取两只1.5mLEP管,标记为实验组和对照组,并向每支管中分别加入25μL GST-beeds20%乙醇充分混合液。 2、加入Washbuffer1洗涤两次,每次500μL,5000rpm,4℃离心30s去除上 清液。Washbuffer配比如下:
3)、加入1 ml wash buffer,颠倒混匀,短暂离心后置于磁力架上,待溶液澄清,弃上清。 4)、重复步骤2三次,一共洗四次。 5)、分别将上述蛋白全部转移到磁珠中,4℃旋转孵育1 h。 6)、短暂离心后置于磁力架上,待溶液澄清,弃上清。 7)、加入1 ml wash buffer,颠倒混匀,短暂离心后置于磁力架上,待溶液澄清,弃...
蛋⽩相互作⽤Pull-Down实验 实验原理：Pull-Down技术是通过蛋⽩相互作⽤来研究细胞通路的有⼒⼯具。是确定两种或更多蛋⽩之间相互作⽤的体外⽅法。Pull-Down实验可⽤来检测已知的蛋⽩相互作⽤条件，并且可⽤来筛选未知的蛋⽩相互作⽤。⽤作诱饵的蛋⽩是重组蛋⽩，会含有⼀个⽤于...
电泳检测每种wash buffer的最佳用量(防止将蛋白洗脱) 10、用Elution buffer洗脱蛋白2-4次,每次0.5ml,取1ul洗脱液在NC膜上,丽春红染色,颜色越深,蛋白量越大,取蛋白量最大的做Pull down Lysis buffer 50mM NaH2PO4,PH8.0 300mM Nacl 10mMImidazole Wash buffer 1 50mM NaH2PO4,PH8.0 300mM Nacl 20mM Imidazole...
2、将孵育好的磁珠-RNA-蛋白混合物低速离心,使用Wash BufferII冲洗6次,每次500ul。 3、将上清吸除干净,于磁珠中加40uL Wash Buffer 和10µL 5×SDS上样缓冲液,95℃变性10min,作为SDS-PAGE凝胶电泳的样品。 2.4 银染 1、固定:电泳结束后,取凝胶放入约20ml固定液中,在摇床上室温摇动≥40min,摇动速度为60...