随后用1×Wash Buffer清洗RNA结合蛋白混合物3次,加入Elution Buffer,37oC洗脱30分钟,用loading buffer变性蛋白,用于后续分析。 4、SDS-PAGE分析及银染 所得RNA结合蛋白混合物用于SDS-PAGE分析,使用Thermo Fisher公司的NuPAGE俐4-12%Bis-Tris Protein Gels预...
1)、分别取200 μl纯化的A-GST与B-HIS至同一1.5 ml EP管中, 另取200 μl 纯化的A-GST与GST蛋白至另一1.5 ml EP管中,4℃旋转孵育2 h以上。 2)、从4℃中取出GST-tag magnetic beads,振荡混匀后吸取70 μl磁珠液至一新的1.5 ml EP管中。 3)、加入1 ml wash buffer,颠倒混匀,短暂离心后置于...
GST-pulldown操作说明 GST Pulldown（研究GST-CDC-48与Rpn11相互作用）1、取两只1.5mL EP管，标记为实验组和对照组，并向每支管中分别加入25μL GST-beeds 20%乙醇充分混合液。2、加入Wash buffer 1 洗涤两次，每次500μL，5000rpm，4℃离心30s去除上清液。Wash buffer 配比如下：Tris-HCL 50 mM NaCL 100...
PROBE:目的基因启动子区 二.DNA pull down实验 1实验目的:通过生物素标记的探针,在细胞中钓取与启动子区有相互作用的蛋白;并进行质谱鉴定。 2实验材料 l主要试剂 l主要仪器及器材 3实验方法 l链霉素亲和磁珠与生物素标记的DNA结合 1、磁珠准备:使用Wash Buffer I 500µl冲洗磁珠3次。 2、用Wash Buffer I(...
15)加预冷的wash buffer 2 0.5ml至microspin，4℃ 1000g离心10 sec，弃收集管中的液体，重复清洗6次。16)预冷的wash buffer 3 0.5ml 重复清洗3次。17)最后一次离心，4℃ 10000g离心30 sec。18)加入适量合适分析的1×leammli buffer，煮沸5min洗脱蛋白。19)18×16cm SDS-PAGE分析，质谱鉴定蛋白。Wash ...
2、将孵育好的磁珠-RNA-蛋白混合物低速离心,使用Wash BufferII冲洗6次,每次500ul。 3、将上清吸除干净,于磁珠中加40uL Wash Buffer 和10µL 5×SDS上样缓冲液,95℃变性10min,作为SDS-PAGE凝胶电泳的样品。 2.4 银染 1、固定:电泳结束后,取凝胶放入约20ml固定液中,在摇床上室温摇动≥40min,摇动速度为60...
4) 加入预冷的500μL Wash buffer, 4℃垂直混匀器上摇动 5min洗涤,置于磁力架上静置3min,待澄清后弃上清; 5) 重复上上步骤2次,即共洗涤3次; 5、 GST-pulldown 1) 分别向步骤 4获得的GST-P53及GST管中加入300μL捕获蛋白裂解液; 2) 4℃,垂直混匀器上翻转孵育过夜; 3) 置于磁力架上静置3min,待澄...
加400ul Binding Buffer或wash Buffer再次清洗凝胶。 小心移去上清。 分析:加20ul SDS-PAGE loadingBuffer,在室温下混合5min。取出上清用于 分析。 His Pull-Down方法 实验试剂: Binding Buffer: 20mM Tris-Cl(pH8.0)、150mM NaCl、20mM咪唑 Elution Buffer: 20mM Tris-Cl(pH8.0)、300mM NaCl、500mM咪唑 实验...
4.DNA pull down a.制备binding reaction:加入100 µL 5× EMSA buffer 及包含100 µg 核蛋白 的上清液 ;补水至 500 µL. b. 加500ul binding reaction到磁珠中;常温翻转20min c.磁力架上放置1min,弃上清; d.用wash buffer 洗涤3遍。