下拉实验（pull-down assay）是验证体外蛋白互作的主要方式，也是验证没有成熟抗体的蛋白互作的方式之一。通过体外表达亲和蛋白-GST，将亲和蛋白固化在谷胱甘肽亲和树脂上充当“诱饵蛋白”，将细胞或者组织的总蛋白和此“诱导蛋白”混合孵育后可从中捕获“目标蛋白”，最后通过洗脱的方式将“目标蛋白”洗脱后检测，就可以...
1. 蛋白质样品制备 表达融合标签的蛋白质:在适当的宿主细胞中表达融合标签的蛋白质,通过裂解细胞或纯化蛋白质获得蛋白样品。 目标蛋白质:通过表达系统或直接从细胞裂解物中提取,确保蛋白质处于可溶状态。 2. 蛋白质结合 孵育样品:将融合标签的蛋白质样品加入到装有亲和树脂的离心管中,轻轻混合以确保蛋白质与树脂充分...
pull-down方法及蛋白表达纯化 3. Pull-down方法 LB培养基成分：Tryptone 10 g/L Y east Extract 5 g/L NaCl 10 g/L 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解，继续滴加去离子水定容至1 L，高温高压灭菌后，冷却至室温。固体培养基灭菌前加入Agar（15 g/L），含抗生素的LB灭菌后加入1 ml卡那霉素（Kana...
通过清洗步骤，去除非特异性结合的杂质，随后通过洗脱获取诱饵蛋白和目标蛋白的复合物。根据实验目的，可以选择western blot检测特定蛋白X与诱饵蛋白的互作，或者进行LC-MS/MS分析，以寻找更多可能的互作蛋白。这一步的对照组和实验组处理需要分开进行，以确保结果的准确性。总结来说，Pull-down蛋白质鉴定流程...
pull-down方法步骤汇总 pull-down⽅法步骤汇总 GST-Pull down:1) 利⽤纯化好的蛋⽩进⾏GST-Pull down 实验操作。2) 实验设置2 个组合，第⼀个是实验组(90 µl BP-His +90 µl BRM (689-952aa)-GST)，第⼆个是负对照组(90 µl BP-His + 10 µl GST)，分别在1.5 ml 的离⼼...
二.DNA pull down实验 1实验目的:通过生物素标记的探针,在细胞中钓取与启动子区有相互作用的蛋白;并进行质谱鉴定。 2实验材料 l主要试剂 l主要仪器及器材 3实验方法 l链霉素亲和磁珠与生物素标记的DNA结合 1、磁珠准备:使用Wash Buffer I 500µl冲洗磁珠3次。
GST Pull-Down实验方法 一、载体构建 两个目的蛋白分别构建至植物原核表达载体上。 二、蛋白表达纯化 1.1质粒转化 质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,涂板后37℃倒置培养过夜。 1.2 表达鉴定、优化及可溶性分析 选取单克隆于5管LB培养基37℃培养至菌体OD600为0.6-0.8,加入IPTG至终浓度为0.5mM,培养4h后离心...
pull-down试验方法(自己总结) pull-down试验方法(自己总结) 12、GST蛋白的表达和纯化 12、1 GST蛋白的表达(1) 将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中。(2) 挑单克隆于3ml LA(LB+Amp)培养基中,37℃摇菌过夜,获得 种子液。(3) 将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中,使起始 OD600为0、1。
3.Pull-down方法 LB培养基成分: Tryptone10g/L YeastExtract5g/L NaCl10g/L 加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解,继续滴加去离子水定容至1L,高温 高压灭菌后,冷却至室温。固体培养基灭菌前加入Agar(15g/L),含抗生素的 LB灭菌后加入1ml卡那霉素(Kanamycin,100mg/ml)或者1ml氨苄青霉素后 ...
Pull Down方法是一种利用亲和剂（如GST标签、蛋白A/G磁珠等）将目标蛋白及其相互作用的蛋白一起富集的技术。其基本步骤包括：1）将目标蛋白与亲和剂结合，形成复合物；2）将复合物与亲和剂固定在固相载体上；3）将混合物与固相载体接触，使目标蛋白及其相互作用的蛋白与亲和剂结合；4）洗涤去除非特异性结合的蛋白；...