下拉实验(pull-down assay)是验证体外蛋白互作的主要方式,也是验证没有成熟抗体的蛋白互作的方式之一。通过体外表达亲和蛋白-GST,将亲和蛋白固化在谷胱甘肽亲和树脂上充当“诱饵蛋白”,将细胞或者组织的总蛋白和此“诱导蛋白”混合孵育后可从中捕获“目标蛋白”,最后通过洗脱的方式将“目标蛋白”洗脱后检测,就可以分析蛋...
Pull-down实验是一种有效的验证蛋白之间相互作用的体外实验技术,常用来验证酵母双杂交系统或者其他方法筛选到的互作蛋白。 Pull-down实验基本原理是将靶蛋白亲和固定在基质上,充当“诱饵蛋白”,当细胞抽提液或…
1. 蛋白质样品制备 表达融合标签的蛋白质:在适当的宿主细胞中表达融合标签的蛋白质,通过裂解细胞或纯化蛋白质获得蛋白样品。 目标蛋白质:通过表达系统或直接从细胞裂解物中提取,确保蛋白质处于可溶状态。 2. 蛋白质结合 孵育样品:将融合标签的蛋白质样品加入到装有亲和树脂的离心管中,轻轻混合以确保蛋白质与树脂充分...
pull-down方法及蛋白表达纯化 3. Pull-down方法 LB培养基成分：Tryptone 10 g/L Y east Extract 5 g/L NaCl 10 g/L 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解，继续滴加去离子水定容至1 L，高温高压灭菌后，冷却至室温。固体培养基灭菌前加入Agar（15 g/L），含抗生素的LB灭菌后加入1 ml卡那霉素（Kana...
Pull-down实验是一种体外验证蛋白相互作用的重要方法，尤其适用于验证筛选得到的互作蛋白。该实验的核心在于通过"诱饵蛋白"固定基质，将目标蛋白吸引并结合，非互作蛋白则被洗脱。以下是其详细的鉴定流程：首先，构建带标签的诱饵蛋白表达载体，并通过大肠杆菌原核表达，特别注意选择自诱导培养条件以减少包涵体...
pull-down方法步骤汇总 pull-down⽅法步骤汇总 GST-Pull down:1) 利⽤纯化好的蛋⽩进⾏GST-Pull down 实验操作。2) 实验设置2 个组合，第⼀个是实验组(90 µl BP-His +90 µl BRM (689-952aa)-GST)，第⼆个是负对照组(90 µl BP-His + 10 µl GST)，分别在1.5 ml 的离⼼...
pull-down试验方法(自己总结) pull-down试验方法(自己总结) 12、GST蛋白的表达和纯化 12、1 GST蛋白的表达(1) 将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中。(2) 挑单克隆于3ml LA(LB+Amp)培养基中,37℃摇菌过夜,获得 种子液。(3) 将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中,使起始 OD600为0、1。
pull down 实验方法 一、实验准备。 咱得先把实验要用的东西都准备好哈。这个pull down实验呢,需要一些关键的试剂和材料。比如说特异性抗体,这玩意儿可重要啦,就像是一个精准的小导航,能帮咱找到咱想要研究的目标蛋白。还有蛋白A或者蛋白G琼脂糖珠,它们就像是小磁铁一样,能把抗体和目标蛋白给“吸”在一起。
GST Pull-Down实验方法 一、载体构建 两个目的蛋白分别构建至植物原核表达载体上。 二、蛋白表达纯化 1.1质粒转化 质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,涂板后37℃倒置培养过夜。 1.2 表达鉴定、优化及可溶性分析 选取单克隆于5管LB培养基37℃培养至菌体OD600为0.6-0.8,加入IPTG至终浓度为0.5mM,培养4h后离心...
3.Pull-down方法LB培养基成分:Tryptone10g/LYeastExtract5g/LNaCl10g/L加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解,继续滴加去离子水定容至1L,高温高压灭菌后,冷却至室温。固体培养基灭菌前加入Agar(15g/L),含抗生素的LB灭菌后加入1ml卡那霉素(Kanamycin,100mg/ml)或者1ml氨苄青霉素后(Ampicillin,100mg/ml)混匀,4℃...