一、GST pull-down 基本知识 GST pull-down技术是体外条件下研究蛋白质相互作用的方法。先将体外表达的GST融合蛋白结合到谷胱甘肽Beads上,再将靶蛋白-GST-Beads和细胞裂解液孵育,这样互作蛋白便一起吸附在Beads…
GST Pull down实验方法如下: 一、GST-a融合蛋白的表达 1.将目的蛋白与GST的重组质粒转化到BL21菌株中; 2.挑取单克隆到含有5 ml LB培养基(加入5 μl氨苄)的10 ml试管里,37℃恒温振荡培养箱中培养过夜; 3.将培养菌液转移到含有500 ml LB(含500 μl氨苄)的1L锥形瓶中,37℃,200 rpm培养数小时; 4.测定...
DNA pull-down实验首先针对靶标区域设计特异性DNA探针,探针经过脱硫生物素标记,跟偶联在磁珠上的链霉亲和素结合;细胞核提取物与磁珠-DNA探针孵育,作用蛋白质分子可以和DNA探针特异性结合;纯化出与靶DNA片段结合的蛋白复合体,经过洗涤可...
GST Pull Down实验是一种常用的蛋白质相互作用检测方法,通过这种实验可以深入了解蛋白质之间的相互作用关系。以下是详细的实验设计步骤: 一、实验材料准备 载体:选择pGEX系列载体,如pGEX-4T-1。 大肠杆菌感受态细胞:BL21(DE3)。 克隆酶:DNA聚合酶、限制性内切酶、连接酶等。 培养基和诱导物:GST蛋白表达所需的培养基...
GST下拉实验流程 ①构建表达载体：目的基因克隆或目的基因合成；限制性内切酶酶切骨架载体并纯化；目的基因插入骨架载体；转化大肠杆菌，筛选阳性克隆并测序鉴定； ②转化表达菌株：将目的表达载体转化表达菌株； ③制备目的蛋白：诱导目的蛋白表达并提取目的蛋白； ④GST-pull down实验； ⑤Western...
一、实验目的:构建GST-P53融合表达载体,并过表达此蛋白。通过GST-pull down沉淀细胞中与P53蛋白互作的其他蛋白,并通过WB鉴定P53与HSP70是否互作。 二、实验材料 l主要试剂 l主要仪器及器材 三、实验方法 1、捕获蛋白制备 1)收集的细胞中加入1mL预冷的PBS;吹打混匀后,1500g 离心 5 min,去除上清,再重复洗涤细胞...
GST Pull-down实验用于研究蛋白之间的直接或间接相互作用，此外还可以结合色谱串联质谱（LC-MS/MS）筛选已知蛋白的未知互作蛋白。由于实验时需要将蛋白在体外纯化出来，因此这种方法属于体外研究蛋白互作的方法。实验原理 GST Pull-down实验的基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，作为与目的蛋白...
GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE...