8.在Pull down实验之前,解冻准备好的细胞提取物。4°C, 17000 × g 离心20分钟。使用上清液作为猎物。 3.2以细胞裂解液为猎物的Pull down试验。 1.将120 μL Ni-NTA 琼脂糖珠转移到重力流柱上。 2. 4°C, 1000 × g离心 1 min。 3.向柱中加入400 μL蒸馏水。 4. 4°C, 1000 × g离心 1 min。
下拉实验（pull-down assay）是验证体外蛋白互作的主要方式，也是验证没有成熟抗体的蛋白互作的方式之一。通过体外表达亲和蛋白-GST，将亲和蛋白固化在谷胱甘肽亲和树脂上充当“诱饵蛋白”，将细胞或者组织的总蛋白和此“诱导蛋白”混合孵育后可从中捕获“目标蛋白”，最后通过洗脱的方式将“目标蛋白”洗脱后检测，就可以...
Pull-down实验的基本原理是利用蛋白质之间的特异性相互作用来筛选和鉴定与感兴趣蛋白相互作用的蛋白质。在实验中,首先将感兴趣的蛋白质(通常是已知的蛋白质)与特定的标签(如GST、HIS等)融合,并表达在宿主细胞中。然后,将这些标记蛋白与细胞提取物或重组蛋白混合,使它们在体外环境中进行相互作用。在混合过程中,与标记...
将洗脱样透析至Buffer(PBS,300mM NaCl, 2mMDTT, pH7.4)中,目的蛋白有沉淀产生,过滤除菌,干冰发货。 三、pull down 实验 1)、分别取200 μl纯化的A-GST与B-HIS至同一1.5 ml EP管中, 另取200 μl 纯化的A-GST与GST蛋白至另一1.5 ml EP管中,4℃旋转孵育2 h以上。 2)、从4℃中取出GST-tag ...
详细实验操作步骤:探针法RNA pull-down,这样做!, 视频播放量 3317、弹幕量 1、点赞数 70、投硬币枚数 11、收藏人数 206、转发人数 28, 视频作者 金开瑞生物, 作者简介 实验问题咨询及生物类合作咨询:13343461158; 蛋白抗体、检测分析/分子互作、基因/引物合成各生物领
2.GST pull down实验步骤 GST-a融合蛋白的制备 1.GST-a融合蛋白的表达 (1)将目的蛋白与GST的重组质粒转化到BL21菌株中; (2)挑取单克隆到含有5ml LB培养基(加入5ul氨苄)的10ml试管里,37℃恒温振荡培养箱中培养过夜; (3)将培...
在pulldown实验中,DNA序列通常是作为配体固定在固相介质上,而蛋白质则是靶蛋白。通过将混合物与固相介质接触,靶蛋白与固相上的DNA结合,而其他非特异性结合的蛋白质则被洗脱掉。最终,只有与DNA特异性结合的蛋白质被富集下来。 二、实验步骤 1. 准备工作 a. 合成或克隆目标DNA序列,并将其连接到适当的表达载体上。
(2)蛋白质Pull-down的主要步骤 ①GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育,包括:a.单一明确的重组蛋白;b.细胞裂解蛋白混合液;c.体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白。 ②混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠在4℃反应2h,离心得沉淀。 ③沉淀加入Loading Buffer煮沸3min,高速离心,取上清液进行SDS-PAGE电泳。 ④考马斯亮蓝对SDS-PAG...
RNA pull down 实验步骤1、构建 RNA 过表达质粒：基因合成 +测序验证；2、体外转录模板准备：设计含 T7 启动子引物，PCR 扩增得到转录模板；3、体外转录：以 PCR 产物为模板，体外转录得到目的 RNA；4、RNA pull down ：通过磁珠 -RNA 探针复合物富集互作的蛋白；5、银染质检：SDS -PAGE 电泳银染检测富集蛋白...
GST pull down 实验详细步骤#科研 #实验室日常 - 广州基云生物GCBio于20240812发布在抖音,已经收获了253个喜欢,来抖音,记录美好生活!