Pull down实验步骤 一、Pull down实验特点 Pull down实验是一种广泛用于检测或确认多种蛋白质之间相互作用的体外方法[1]。该方法类似于免疫共沉淀实验,使用亲和配体捕获相互作用蛋白。这两种方法的不同之处在于,…
Pull-down验证蛋白互作原理图 实验步骤: 1、构建载体 在进行载体构建时,通常会用常见的蛋白质标签,如GST(谷胱甘肽S-转移酶)、HIS(组氨酸富集标签)、MBP(麦芽糖结合蛋白)等。这些标签对应着多种载体,常见的有PET系列(如pET-28a)和PGEX系列载体(如pGEX-4T1)。 2、检测蛋白表达 1)将构建好的载体转化到BL21大肠杆...
二、GST Pull-Down实验：利用DNA重组技术将已知蛋白与GST融合，而融合蛋白通过GST与固化在载体上的GTH（谷胱甘肽）亲和结合。简单来说，我们假定a蛋白和b蛋白可能存在互作，将纯化的融合GST的a蛋白和纯化的b蛋白以及能特异性结合GST的Sephrose 4B beads混合在一起孵育一定时间，然后洗去未结合的蛋白，煮沸beads进行SDS-...
接下来就是反转录了。这一步也很关键,毕竟我们要把RNA变成cDNA才能进行后续的实验。具体操作如下: 配制RT反应液:在冰上进行这个步骤。为了减少误差,建议稍微多配一点反应液,最后再加入RNA样品。 反转录程序:按照37℃,15min;85℃,5sec的程序进行反转录。完成后,把cDNA放在-20℃保存备用。 定量PCR检测 📊 最后...
DNA pull down实验流程(如图):获取目的DNA片段DNA探针合成生物素磁珠结合DNA探针与蛋白孵育蛋白洗脱产物WB检测or质谱检测实验具体步骤: 1.探针设计及标记(1)采用基因组DNA做模板,经PCR扩增启动子片段;(2)预先混合5µg生物素标记的DNA和500µg核蛋白,置于冰上;(...
通过Western blot检测结果,我们可以看到GST-a蛋白和b蛋白所对应的条带,即表明了a蛋白和b蛋白因发生相互作用而被GST-a pull down(GST对照只显示一个条带)。 GST pull down 一、 1.GST-a融合蛋白的表达 (1)将目的蛋白与GST的重组质粒转化到BL21菌株中; (2)挑取单克隆到含有5ml LB培养基(加入5ul氨苄)的...
DNA Pull down 实验的基本步骤 1. DNA探针的设计和标记：设计含有感兴趣的特定序列的双链DNA探针。通常，探针末端会附加一个标签，用于后续捕获，如生物素（biotin）标记。2. 固相载体结合：将标记有生物素的DNA探针与链霉亲和素（streptavidin）偶联的琼脂糖珠（或磁珠）结合，生物素-链霉亲和素的强相互作用使DNA...
一、实验准备。 咱得先把实验要用的东西都准备好哈。这个pull down实验呢,需要一些关键的试剂和材料。比如说特异性抗体,这玩意儿可重要啦,就像是一个精准的小导航,能帮咱找到咱想要研究的目标蛋白。还有蛋白A或者蛋白G琼脂糖珠,它们就像是小磁铁一样,能把抗体和目标蛋白给“吸”在一起。另外,裂解缓冲液也不能...
GST pulldown实验流程图文详解。1️⃣ 蛋白的抽提与纯化 原核表达蛋白分离纯化: (1)在裂解液上清中加入适量体积50%谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B,4℃摇床上缓慢摇动30~60min; (2)4℃,4000rpm离心5min,弃去上清; (3)加入200ul预冷的PBS溶液,轻晃悬浮珠子,洗涤一次,4℃,4000rpm离心5min,弃去上清,重复此步骤3次...
pull down 实验方法PullDown实验流程 1.混合两种预测相互作用的蛋白。(Protein-A-GST &Protein-B-HIS,下面实验用GST树脂IP,用WesternBlot检测HIS;反之亦然。如果是纯化后的蛋白,需要进行偷袭或者使用超滤离心管为蛋白更换溶液,之后才能继续PullDown。) 2.加入1 mL Binding Buffer。 Binding Buffer:50 mM Tris.HCl...