8. 在Pull down实验之前,解冻准备好的细胞提取物。4°C, 17000 × g 离心20分钟。使用上清液作为猎物。 3.2 以细胞裂解液为猎物的Pull down试验。 1.将120 μLNi-NTA 琼脂糖珠转移到重力流柱上。 4°C, 1000 × g离心 1 min。 3.向柱中加入400 μL蒸馏水。 4. 4°C, 1000 × g离心 1 min。
GST pull-down 实验是验证蛋白质间相互作用的关键手段，它借助谷胱甘肽转移酶（GST）标签与谷胱甘肽琼脂糖珠的特异亲和性，来捕获并鉴定与 GST 融合蛋白相结合的靶蛋白。以下详细阐述该实验的步骤与要点。一、前期筹备 （一）试剂与材料 1. 实验组：能表达 GST 融合蛋白的细菌或细胞裂解液，这里面含有待研究的 GST...
Pull-down验证蛋白互作原理图 实验步骤: 1、构建载体 在进行载体构建时,通常会用常见的蛋白质标签,如GST(谷胱甘肽S-转移酶)、HIS(组氨酸富集标签)、MBP(麦芽糖结合蛋白)等。这些标签对应着多种载体,常见的有PET系列(如pET-28a)和PGEX系列载体(如pGEX-4T1)。 2、检测蛋白表达 1)将构建好的载体转化到BL21大肠杆...
（3）体外转录：将步骤2中获得的PCR产物，用体外转录试剂盒进行体外转录实验以获得目标RNA（含 sense 及 Anti-sense 两组）；在体外转录的过程中，主要由T7 RNA聚合酶将转录模板DNA转录成RNA；（4）RNA生物素标记：为了方便RNA-蛋白的富集，需要在RNA 3'端进行生物素标记或者标签标记，然后与链霉亲和素磁珠结合...
①构建表达载体：目的基因克隆或目的基因合成；限制性内切酶酶切骨架载体并纯化；目的基因插入骨架载体；转化大肠杆菌，筛选阳性克隆并测序鉴定； ②转化表达菌株：将目的表达载体转化表达菌株； ③制备目的蛋白：诱导目的蛋白表达并提取目的蛋白； ④GST-pull down实验； ⑤Western Blot检测目的...
GST-pull-down实验原理与步骤 GST pull down（GST融合蛋白沉降技术）是体外检测蛋白相互作用的常用方法，可验证已知蛋白之间的互作，也可用于筛选与已知蛋白互作的未知蛋白。此方法操作方便，简单易行。GST pull down的主要原理是利用DNA重组技术将已知蛋白与GST融合，而融合蛋白通过GST与固化在载体上的GTH（谷胱甘肽）...
Pull Down 实验的基本步骤 1. 融合蛋白的制备：通常将蛋白（bait，诱饵蛋白）与一个标签（如 GST、His、Flag 等）融合表达。GST pull down 实验是常用的一种类型，其中诱饵蛋白与谷胱甘肽S-转移酶 (GST) 融合。2. 固相载体结合：通过选择与标签结合的固相载体，如用于GST 标签的谷胱甘肽琼脂糖珠，或用于 His ...
RNA-Pull down实验详细操作方法步骤：一、细胞收集(对于单层细胞或贴壁细胞)准备细胞5E7细胞。用10 mL冰冷的PBS洗涤培养瓶或平板上的细胞两次。加入10 mL冰冷的PBS。从每个培养瓶或平板上刮下细胞，然后转移到离心管。通过在4°C下以1500 rpm离心5 min来收集细胞，并丢弃上清液。细胞沉淀-80℃保存。二、细胞裂解 ...
3.4 Pull Down （1）安装柱子，用PBS平衡柱子（加入使其自然流下）（2）加入2 mL GST-A到一个封闭的GST柱子,4℃ rotate混匀6 h。（3）将孵育液流出后（收F1），用已预冷的300 mL 1×PBS洗涤GST柱子约20次（6ml加入后上下盖子盖好颠倒混匀，打开流出），4℃；（流出的PBS要收集，洗涤液收集3管，刚...