1. 融合蛋白的制备：通常将蛋白（bait，诱饵蛋白）与一个标签（如 GST、His、Flag 等）融合表达。GST pull down 实验是常用的一种类型，其中诱饵蛋白与谷胱甘肽S-转移酶 (GST) 融合。2. 固相载体结合：通过选择与标签结合的固相载体，如用于GST 标签的谷胱甘肽琼脂糖珠，或用于 His 标签的镍柱，将融合蛋白固定到...
Pull-down实验，又称拉下实验，是一种体外亲和纯化技术。（这个实验跟免疫共沉淀实验很像，不同的是免疫共沉淀是在细胞里进行的。）一、原理：将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），但细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。被吸附的...
RNA Pull-down技术实验流程主要包括以下几个步骤：（1）构建含目的基因序列质粒：选择自己感兴趣的基因，根据其序列用同源重组方式或全基因合成构建含目的基因序列质粒；并测序验证序列准确性，并提取含目的基因序列质粒备用；（2）转录模板的获取：T7 RNA聚合酶特异性识别来自T7噬菌体的启动子序列。为了使T7 RNA聚合...
Pull down实验步骤 一、Pull down实验特点 Pull down实验是一种广泛用于检测或确认多种蛋白质之间相互作用的体外方法[1]。该方法类似于免疫共沉淀实验,使用亲和配体捕获相互作用蛋白。这两种方法的不同之处在于,…
Pull-down实验的基本原理是基于蛋白质之间的特异性和亲和性相互作用。通过选择适当的标签和实验条件,可以准确地研究感兴趣蛋白质与其他蛋白质之间的相互作用,从而深入了解这些相互作用在细胞功能中的作用机制。 Pull-down验证蛋白互作原理图 实验步骤: 1、构建载体 在进行载体构建时,通常会用常见的蛋白质标签,如GST(谷...
嘿,大家好!今天我们来聊聊RNA Pull down实验,这可是个挺有意思的实验哦!不过,这个实验步骤有点多,咱们一步一步来,慢慢搞定。 RNA提取 🧬 首先,咱们得提取RNA。这个步骤其实还挺关键的,毕竟RNA这东西很脆弱,稍微不注意就搞砸了。具体操作如下: 准备样品:把你的Input样品、sense、antisense和beads分别放进1ml的...
GST pull down 一、 1.GST-a融合蛋白的表达 (1)将目的蛋白与GST的重组质粒转化到BL21菌株中; (2)挑取单克隆到含有5ml LB培养基(加入5ul氨苄)的10ml试管里,37℃恒温振荡培养箱中培养过夜; (3)将培养菌液转移到含有500ml LB(含500ul氨苄)的1L锥形瓶中,37℃,200rpm培养数小时; (4)测定OD600值,当OD600达...
GST pull-down实验经过考马斯亮蓝和Western blot检测后即可进行结果分析。 考马斯亮蓝检测:通过考染胶中纯化条带区别于未纯化样品条带的分布情况,可以明显看出纯化后的探针蛋白A,在实验组与对照组中都有分布;下面与蛋白A互作的未知蛋白在实验组中存在,在对照组中不存在,证明实验体系与结果准确有效。