2.实验流程 DNA pull-down实验首先针对靶标区域设计特异性DNA探针,探针经过脱硫生物素标记,跟偶联在磁珠上的链霉亲和素结合;细胞核提取物与磁珠-DNA探针孵育,作用蛋白质分子可以和DNA探针特异性结合;纯化出与靶DNA片段结合的蛋白复合体,经过洗涤可以将非特异性结合蛋白质去除;最后,经洗脱液洗脱,得到目的DNA探针-蛋白...
Pull-down实验的基本原理是基于蛋白质之间的特异性和亲和性相互作用。通过选择适当的标签和实验条件,可以准确地研究感兴趣蛋白质与其他蛋白质之间的相互作用,从而深入了解这些相互作用在细胞功能中的作用机制。 Pull-down验证蛋白互作原理图 实验步骤: 1、构建载体 在进行载体构建时,通常会用常见的蛋白质标签,如GST(谷...
1. 融合蛋白的制备：通常将蛋白（bait，诱饵蛋白）与一个标签（如 GST、His、Flag 等）融合表达。GST pull down 实验是常用的一种类型，其中诱饵蛋白与谷胱甘肽S-转移酶 (GST) 融合。2. 固相载体结合：通过选择与标签结合的固相载体，如用于GST 标签的谷胱甘肽琼脂糖珠，或用于 His 标签的镍柱，将融合蛋白固定到...
RNA Pull-down技术实验流程主要包括以下几个步骤：（1）构建含目的基因序列质粒：选择自己感兴趣的基因，根据其序列用同源重组方式或全基因合成构建含目的基因序列质粒；并测序验证序列准确性，并提取含目的基因序列质粒备用；（2）转录模板的获取：T7 RNA聚合酶特异性识别来自T7噬菌体的启动子序列。为了使T7 RNA聚合...
Pull down实验步骤 一、Pull down实验特点 Pull down实验是一种广泛用于检测或确认多种蛋白质之间相互作用的体外方法[1]。该方法类似于免疫共沉淀实验,使用亲和配体捕获相互作用蛋白。这两种方法的不同之处在于,免疫共沉淀使用固定抗体来捕获蛋白质复合物,而Pull down方法使用纯化和标记的蛋白质作为“诱饵”来结合任何...
RNA-Pull down实验详细操作方法步骤：一、细胞收集(对于单层细胞或贴壁细胞)准备细胞5E7细胞。用10 mL冰冷的PBS洗涤培养瓶或平板上的细胞两次。加入10 mL冰冷的PBS。从每个培养瓶或平板上刮下细胞，然后转移到离心管。通过在4°C下以1500 rpm离心5 min来收集细胞，并丢弃上清液。细胞沉淀-80℃保存。二、细胞裂解 ...
蛋白质Pull-down实验原理与主要步骤。 答案 (1)实验原理;通过与GST融合蛋白质探针蛋白质相互作用从可溶性蛋白质库中亲和纯化一个未 知蛋白质,再通过CST与谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的结合收集相互作用蛋白质,从而分离出蛋白质复 合物。 (2)主要步骤;①GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育(a.单一明确的重组蛋白;b...
下拉实验（pull-down assay）是验证体外蛋白互作的主要方式，也是验证没有成熟抗体的蛋白互作的方式之一。通过体外表达亲和蛋白-GST，将亲和蛋白固化在谷胱甘肽亲和树脂上充当“诱饵蛋白”，将细胞或者组织的总蛋白和此“诱导蛋白”混合孵育后可从中捕获“目标蛋白”，最后通过洗脱的方式将“目标蛋白”洗脱后检测，就可以...
4、GST pull-down 实验流程 ①蛋白的抽提与纯化:原核表达蛋白分离纯化。 在裂解液上清中加入适量体积50%谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B,4℃摇床上缓慢摇动30~60min; 4℃,4000rpm离心5min,弃去上清; 加入200ul预冷的PBS溶液,轻晃悬浮珠子,洗涤一次,4℃,4000rpm离心5min,弃去上清,重复此步骤3次; ...