qPCR引物设计流程与普通PCR一致,但相较于普通PCR的引物设计原则,qPCR更为严格,具体如下:1. 引物的退火温度要高,一般要在60℃以上;2. 引物的产物大小不要太大,一般在80-250bp之间都可; 3. 对于定量PCR来说,特别是在使用SYBR Green的情况下,引物二聚体的存在对结果的干扰较大,所以在选择引物时要尽量避免容易...
(1)MeRIP-qPCR不需要内参来进行样本间的均一化矫正 从结果的形式%(IP/Input)我们也可以看到,这个实验侧重看修饰的片段(IP样品qPCR结果)占总片段(Input样品qPCR结果)的比例,实验目的只是要得到这两者的比值就体现修饰水平,因此MeRIP-qPCR不涉及到普通的相对定量qPCR...
1)MeRIP-qPCR的目的 与普通的qPCR有所不同,MeRIP-qPCR是验证某个目标基因上的某个修饰位点(以一小段区域的形式,MeRIP法精确不到单碱基)的修饰水平。得到的结果往往是一个%(IP/Input)的数值,它体现的是该位点的修饰水平(目标基因发生该修饰的转录本占该基因总转录本的比例),而普通qPCR验证的是某个基因的表达水...
qPCR引物设计流程与普通PCR一致,但相较于普通PCR的引物设计原则,qPCR更为严格,具体如下: 1. 引物的退火温度要高,一般要在60℃以上; 2. 引物的产物大小不要太大,一般在80-250bp之间都可; 3. 对于定量PCR来说,特别是在使用SYBR Green的情况下,引物二聚体的存在对结果的干扰较大,所以在选择引物时要尽量避免...
MeRIP-qPCR的目的是对定量修饰位点的表达水平,因此设计的引物不仅要针对目标基因,还要针对基因上发生修饰的位点(区域)。那修饰位点的信息怎么获得呢?一般有以下几个途径: (1)从MeRIP-seq的测序结果中筛选获得: MeRIP-seq报告结果中通常会给出发生甲基化修饰的位置坐标(如云序生物报告中会以chr1:111234-111567的形式...
设计MeRIP-qPCR引物以验证p65 mRNA上的m6A修饰。潜在的m6A位点以红色标出(上),MeRIP-qPCR引物用箭头表示。MeRIP-qPCR用引物#2和#3(较低)验证了m6A修饰。 YTHDF1-RIP测序分析结果表明,与IgG对照相比,p65 mRNA富集(左)。YTHDF1-RIP-qPCR的小鼠p65 mRNA特异性引物(右)。
设计MeRIP-qPCR引物以验证p65 mRNA上的m6A修饰。潜在的m6A位点以红色标出(上),MeRIP-qPCR引物用箭头表示。MeRIP-qPCR用引物#2和#3(较低)验证了m6A修饰。 YTHDF1-RIP测序分析结果表明,与IgG对照相比,p65 mRNA富集(左)。YTHDF1-RIP-qPCR的小鼠p65 mRNA特异性引物(右)。
3.MeRIP-qPCR引物如何设计? 由于目的是定量位点的修饰水平,因此MeRIP-qPCR的引物不*是针对目标基因,还要是针对其上的那个修饰位点(区域)。这个位点信息可以从: (1)MeRIP-seq的测序结果中筛选得来 通常是一段位置坐标,比如云序生物提供的MeRIP-seq结果,某个甲基化峰位置如:chr1:111234-111567。有了这个位置信息,可...
C.设计MeRIP-qPCR引物以验证p65 mRNA上的m6A修饰。潜在的m6A位点以红色标出(上),MeRIP-qPCR引物用箭头表示。MeRIP-qPCR用引物#2和#3(较低)验证了m6A修饰。 D.YTHDF1-RIP测序分析结果表明,与IgG对照相比,p65 mRNA富集(左)。Y...
由于目的是定量位点的修饰水平,因此MeRIP-qPCR的引物不仅是针对目标基因,还要是针对其上的那个修饰位点(区域)。这个位点信息可以从: (1)MeRIP-seq的测序结果中筛选得来 通常是一段位置坐标,比如云序生物提供的MeRIP-seq结果,某个甲基化峰位置如:chr1:111234-111567。有了这个位置信息,可以去UCSC genome browser网站:...