简介 斑点杂交(dotblot)是一种检测,分析和鉴定 dna,rna和蛋白质的技术,通过显影斑点的有无及颜色的深浅来判断是否有杂交及其杂交强度.作为目前高等真核生物和植物中最丰富的一种 rna转录后修饰,m 6 a修饰能够调控 rna的剪接与转运,稳定性,出核和翻译成蛋白质的效率.因此在...
1 总m6A修饰水平检测 (1)斑点杂交(Dot-blot) 将RNA全部提取出来,点在NC膜上,紫外交联固定,然后用m6A抗体进行杂交,洗膜,放射自显影,以斑点有无或颜色的深浅代表m6A修饰水平的高低。这个方法缺点就是误差很大,而且也不能精确判断某一特定RNA的修饰。 (2)液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS) 基于LC-MS的方法用于RNA...
图2 Dot Blot实验结果[2] 图3 敲除/过表达FIP、MTA表型特征分析[2] 这类分子实验通过敲除/过表达等方式制造出甲基化修饰的极端情况,事实上充当着阴/阳性对照的作用,有了这类实验样本的加入我们可以更直观看到m6A甲基化修饰对功能、表型的影响,还能够通过结合MeRIP-seq测序找到潜在受m6A调控的靶基因,进行基因层面...
经过凝胶纯化和核酸酶P1消化后,通过TLC确定m6A修饰状态(图2)。SCARLET技术的应用受到其复杂步骤、长实验时间和使用放射性试剂的限制。 图2:单基因m6A位点检测方法 位点特异性m6A检测方法示意图:MeRIP-qRT-PCR、SELECT和SCARLET。 总结而言,目前已经开发出的不同层面m6A修饰检测方法主要有: 1)整体水平检测:TLC、Dot-...
收集并提取37例HCC病人的肿瘤及瘤旁组织总RNA及mRNA，通过斑点杂交（Dot Blot）实验和LC-MS／MS发现肿瘤组织总RNA的m6A丰度稍低于瘤旁组织，而mRNA的m6A丰度则显著高于瘤旁组织（图1A）：通过MeRIP-Seq联合RNA-Seq的方法证实肿瘤m6A峰显著增加，且发现大部分甲基化mRNA（69.27％）的表达水平总体较瘤旁组织增高（图...
(E) 用不同浓度的LBH589处理24小时后,眼部黑色素瘤细胞(92.1、OMM2.3和CRMM1)中m6A水平的m6A dot blot。图像代表实验三组。数据以三个生物重复实验的平均值±SD。显著性采用非配对双尾Student t检验确定。 (F) DMSO和LBH589处理组中m6A相关基因相对表达水平的热图。
RNA/mRNA m6A定量检测(Dot Blot)RNA提取与质检、变性与交联、封闭、抗体孵育、显色、定量分析2~3周 客户提供 提供样本 Total RNA样本 细胞样本 组织样本 具体样本要求请详见《RNA甲基化(m6A)检测服务订购表》中附件:《送样要求》。 提供信息 物种信息,单基因检测提供目的基因 ...
总RNA/mRNA m6A/ac4C定量检测(Dot Blot法) 在斑点杂交中,要检测到的生物分子不是首先通过电泳分离出来的,相反,将含有被检测分子的混合物直接点在膜上,烘烤固定。然后与m6A或Ac4C抗体(Western blot)杂交后检测,步骤如下: (1)交联:在65℃下5分钟,使mRNA变性以破坏RNA中的二级结构。变性后立即在冰上冷却,以防止...
首先进行组蛋白修饰抑制剂HDACis对眼部黑色素瘤的抑制作用研究。使用Dot blot法检测整体m⁶A RNA修饰水平。 利用RNA-seq、CUT&Tag、单细胞测序、甲基化RNA免疫沉淀测序(m6A MeRIP-seq)和m⁶A单核苷酸分辨交联和免疫沉淀测序(miCLIP-seq),以揭示HDACis对眼部黑色素瘤中甲基转移酶(METTL14)和FAT肿瘤抑制同源物4...
1. 预实验:dot blot证明短暂局部性缺血后m6A修饰总体水平升高。 为探究小鼠大脑短暂局部性缺血后,m6A修饰总体水平的变化,作者分别选取缺血3h、6h、12h和24h时雄性小鼠和对照小鼠大脑进行dot blot实验,发现12h和24h时,m6A水平明显上升。在雌性小鼠中,短暂缺血24h时,m6A水平显著上升。