构建KI细胞系需要注意的细节 KI细胞系的构建流程是先设计sgRNA及Donor模版,然后通过核糖核蛋白法(Ribonucleoprotein, RNP)或质粒法等方法将sgRNA、Cas蛋白和Donor模板转进细胞中。以RNP法为例,将合成的sgRNA、纯化后的Cas蛋白和Donor模板电转进目标细胞中,通过抗性筛选、PCR鉴定及测序确定KI细胞系是否构建成功。在这个过...
以RNP法为例,将合成的sgRNA、纯化后的Cas9蛋白和Donor模板电转进目标细胞中,通过抗性筛选、PCR鉴定及测序确定KI细胞系是否构建成功。在这个过程中,sgRNA的设计、Donor模板的设计等均会影响最终的编辑结果,下面我们总结了会影响基因编辑效率的部分原因: 1. sgRNA的设计 sgRNA-Cas9在KI基因编辑系统中如“剪刀”一般精准...
首先设计特异性引物并扩增鸡内源性病毒(EAV-HP)左右同源臂和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因表达盒,然后通过重叠延伸PCR技术将两个同源臂DNA连接至eGFP表达盒两侧,获得全长DNA片段LER,并克隆至pMD19-T载体,获得携带eGFP基因的供体载体pMDT-LER。随后在HEK2...
1.一种Jurkat-KI-R5细胞系的构建方法,其特征在于,包括以下步骤: A.得到培养中的Jurkat细胞; B.构建pU6-CCR5-gRNA载体:用BbsI限制性内切酶对pU6-gRNA载体进行酶切,回收;插入DNA双链,所述DNA双链由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3经退火而成;经感受态细胞转化、提取质粒,得到pU6-CCR5-gRNA载体; C.构建修复模板...
摘要 本发明涉及一种Jurkat‑KI‑R5及其构建方法和应用,本发明将强有力的增强子/启动子组合(CAG)通过CRISPR/Cas9基因编辑技术同源重组敲入到CD4+JurkatT细胞的CCR5基因的启动子区,基因修饰的细胞系命名为Jurkat‑KI‑R5细胞。本发明所述Jurkat‑KI‑R5细胞CAG启动子的精确重组到CCR5启动子指定位置,导致CCR5稳...
KI细胞系的构建流程是先设计sgRNA及Donor模版,然后通过核糖核蛋白法(Ribonucleoprotein, RNP)或质粒法等方法将sgRNA、Cas9蛋白和Donor模板转进细胞中。以RNP法为例,将合成的sgRNA、纯化后的Cas9蛋白和Donor模板电转进目标细胞中,通过抗性筛选、PCR鉴定及测序确定KI细胞系是否构建成功。在这个过程中,sgRNA的设计、Donor模...
本发明涉及一种Jurkat‑KI‑R5及其构建方法和应用,本发明将强有力的增强子/启动子组合(CAG)通过CRISPR/Cas9基因编辑技术同源重组敲入到CD4+JurkatT细胞的CCR5基因的启动子区,基因修饰的细胞系命名为Jurkat‑KI‑R5细胞。本发明所述Jurkat‑KI‑R5细胞CAG启动子的精确重组到CCR5启动子指定位置,导致CCR5稳定地高...
本发明涉及一种Jurkat-KI-R5及其构建方法和应用,本发明将强有力的增强子/启动子组合(CAG)通过CRISPR/Cas9基因编辑技术同源重组敲入到CD4+Jurkat T细胞的CCR5基因的启动子区,基因修饰的细胞系命名为Jurkat-KI-R5细胞.本发明所述Jurkat-KI-R5细胞CAG启动子的精确重组到CCR5启动子指定位置,导致CCR5稳定地高表达.和母系...
本发明涉及一种JurkatKIR5及其构建方法和应用,本发明将强有力的增强子/启动子组合(CAG)通过CRISPR/Cas9基因编辑技术同源重组敲入到CD4+Jurkat T细胞的CCR5基因的启动子区,基因修饰的细胞系命名为JurkatKIR5细胞.本发明所述JurkatKIR5细胞CAG启动子的精确重组到CCR5启动子指定位置,导致CCR5稳定地高表达.和母系Jurkat细胞...
(Donor DNA)为模板进行,进而将报告基因插入到ARID5A的3'端,获得单一稳定的HEK293ARID5AT2AluciferaseKI细胞系.结果表明,该HEK293ARID5AT2ALuciferase细胞系内的Luciferase表达水平可以准确灵敏地反映该细胞系内ARID5A分子表达水平,有助于ARID5A基因功能研究及筛选影响ARID5A表达的上游转录因子或小分子化学药物,为与ARID5A...