构建KI细胞系需要注意的细节 KI细胞系的构建流程是先设计sgRNA及Donor模版,然后通过核糖核蛋白法(Ribonucleoprotein, RNP)或质粒法等方法将sgRNA、Cas蛋白和Donor模板转进细胞中。以RNP法为例,将合成的sgRNA、纯化后的Cas蛋白和Donor模板电转进目标细胞中,通过抗性筛选、PCR鉴定及测序确定KI细胞系是否构建成功。在这个过...
构建KI细胞系需要注意的细节 KI细胞系的构建流程是先设计sgRNA及Donor模版,然后通过核糖核蛋白法(Ribonucleoprotein, RNP)或质粒法等方法将sgRNA、Cas蛋白和Donor模板转进细胞中。以RNP法为例,将合成的sgRNA、纯化后的Cas蛋白和Donor模板电转进目标细胞中,通过抗性筛选、PCR鉴定及测序确定KI细胞系是否构建成功。在这个过...
以RNP法为例,将合成的sgRNA、纯化后的Cas9蛋白和Donor模板电转进目标细胞中,通过抗性筛选、PCR鉴定及测序确定KI细胞系是否构建成功。在这个过程中,sgRNA的设计、Donor模板的设计等均会影响最终的编辑结果,下面我们总结了会影响基因编辑效率的部分原因: 1. sgRNA的设计 sgRNA-Cas9在KI基因编辑系统中如“剪刀”一般精准...
首先设计特异性引物并扩增鸡内源性病毒(EAV-HP)左右同源臂和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因表达盒,然后通过重叠延伸PCR技术将两个同源臂DNA连接至eGFP表达盒两侧,获得全长DNA片段LER,并克隆至pMD19-T载体,获得携带eGFP基因的供体载体pMDT-LER。随后在HEK2...
KIF4A有丝分裂纺锤体中央区小分子干扰RNA胃癌细胞目的 构建稳定低表达染色体驱动蛋白KIF4A的胃癌细胞系,观察KIF4A低表达细胞的有丝分裂期纺锤体中央区的形成.方法 针对人类驱动蛋白KIF4A mRNA的编码区设计特异性siRNA序列,构建KIF4A短发夹RNA(shRNA)表达质粒pGPU-GFP-KIF4A.将质粒转染胃癌细胞 SGC-7901,经过G418...
本发明公开了一种构建靶向ARID5A的KIT2ALuciferase细胞系的方法,该方法利用CRISPR/Cas9系统在基因组上ARID5A基因的3'端产生双链切口(DSBs),在Cas9sgRNA组分中加入一个供体载体(Donor DNA),该供体载体(Donor DNA)上带有靶向位点两端的同源序列,DSBs的修复会以供体载体(Donor DNA)为模板进行,进而将报告基因插入到ARID...
一种jurkat-ki-r5细胞系的建立方法,包括以下步骤: a.培养jurkat细胞; b.构建pu6-ccr5-grna载体:用bbsi限制性内切酶对pu6-grna载体进行酶切,回收;插入dna双链,所述dna双链由seqidno.2和seqidno.3经退火成,经感受态细胞转化、提取质粒,得到pu6-ccr5-grna载体; ...
本发明涉及一种JurkatKIR5及其构建方法和应用,本发明将强有力的增强子/启动子组合(CAG)通过CRISPR/Cas9基因编辑技术同源重组敲入到CD4+Jurkat T细胞的CCR5基因的启动子区,基因修饰的细胞系命名为JurkatKIR5细胞.本发明所述JurkatKIR5细胞CAG启动子的精确重组到CCR5启动子指定位置,导致CCR5稳定地高表达.和母系Jurkat细胞...
摘要 本发明涉及一种Jurkat‑KI‑R5及其构建方法和应用,本发明将强有力的增强子/启动子组合(CAG)通过CRISPR/Cas9基因编辑技术同源重组敲入到CD4+JurkatT细胞的CCR5基因的启动子区,基因修饰的细胞系命名为Jurkat‑KI‑R5细胞。本发明所述Jurkat‑KI‑R5细胞CAG启动子的精确重组到CCR5启动子指定位置,导致CCR5稳...
供体载体构建及鉴定 本研究构建的供体载体含eGFP表达盒,其两边携带EAV-HP同源序列。首先利用PCR扩增EAV-HP的左右同源臂以及eGFP表达盒,然后通过重叠延伸PCR将3个DNA片段连接,其PCR产物简称LER。最后利用TA克隆将LER片段插入T载体pMD19-T,经菌落PCR、酶切鉴定和DNA测序,证明LER片段成功克隆至T载体,且无突变,获得重组...