构建KI细胞系需要注意的细节 KI细胞系的构建流程是先设计sgRNA及Donor模版,然后通过核糖核蛋白法(Ribonucleoprotein, RNP)或质粒法等方法将sgRNA、Cas蛋白和Donor模板转进细胞中。以RNP法为例,将合成的sgRNA、纯化后的Cas蛋白和Donor模板电转进目标细胞中,通过抗性筛选、PCR鉴定及测序确定KI细胞系是否构建成功。在这个过...
构建KI细胞系需要注意的细节 KI细胞系的构建流程是先设计sgRNA及Donor模版,然后通过核糖核蛋白法(Ribonucleoprotein, RNP)或质粒法等方法将sgRNA、Cas蛋白和Donor模板转进细胞中。以RNP法为例,将合成的sgRNA、纯化后的Cas蛋白和Donor模板电转进目标细胞中,通过抗性筛选、PCR鉴定及测序确定KI细胞系是否构建成功。在这个过...
以RNP法为例,将合成的sgRNA、纯化后的Cas9蛋白和Donor模板电转进目标细胞中,通过抗性筛选、PCR鉴定及测序确定KI细胞系是否构建成功。在这个过程中,sgRNA的设计、Donor模板的设计等均会影响最终的编辑结果,下面我们总结了会影响基因编辑效率的部分原因: 1. sgRNA的设计 sgRNA-Cas9在KI基因编辑系统中如“剪刀”一般精准...
同源臂建议以待突变的目的细胞基因组为模板扩增,避免不同细胞基因组差异导致同源臂不同源,降低重组效率。 4. 细胞类型与生长状态 在瞬转之前应注意细胞类型是否合适,如关注细胞的增殖速度,增殖太慢的细胞发生重组效率也低下。还要保证细胞处于良好的生长状态、处于对数生长期、合适的生长密度、无支原体污染等。 5. ...
本研究构建的供体载体含eGFP表达盒,其两边携带EAV-HP同源序列。首先利用PCR扩增EAV-HP的左右同源臂以及eGFP表达盒,然后通过重叠延伸PCR将3个DNA片段连接,其PCR产物简称LER。最后利用TA克隆将LER片段插入T载体pMD19-T,经菌落PCR、酶切鉴定和DNA测序,证明LE...
(Donor DNA)为模板进行,进而将报告基因插入到ARID5A的3'端,获得单一稳定的HEK293ARID5AT2AluciferaseKI细胞系.结果表明,该HEK293ARID5AT2ALuciferase细胞系内的Luciferase表达水平可以准确灵敏地反映该细胞系内ARID5A分子表达水平,有助于ARID5A基因功能研究及筛选影响ARID5A表达的上游转录因子或小分子化学药物,为与ARID5A...
1.一种Jurkat‑KI‑R5细胞系的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:得到培养中的Jurkat细胞;构建pU6‑CCR5‑gRNA载体:用BbsI限制性内切酶对pU6‑gRNA载体进行酶切,回收;插入DNA双链,所述DNA双链由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3经退火而成;经感受态细胞转化、提取质粒,得到pU6‑CCR5‑gRNA载体;构建修复...
KIF4A有丝分裂纺锤体中央区小分子干扰RNA胃癌细胞目的 构建稳定低表达染色体驱动蛋白KIF4A的胃癌细胞系,观察KIF4A低表达细胞的有丝分裂期纺锤体中央区的形成.方法 针对人类驱动蛋白KIF4A mRNA的编码区设计特异性siRNA序列,构建KIF4A短发夹RNA(shRNA)表达质粒pGPU-GFP-KIF4A.将质粒转染胃癌细胞 SGC-7901,经过G418...
1.一种基于CRISPR-Cas9靶向基因组修饰技术构建Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系的方法,其特征在于,将靶向Egr2基因的打靶载体与打靶供体共转HEK293细胞系,使携带荧光素酶报告基因的打靶载体在Egr2基因组下游目标位点处正确重组,重组基因受内源性Egr2基因启动子的调控,获得单一稳定的Egr2-Luciferase-KI-HEK293细胞系,并验...
摘要 本发明涉及一种Jurkat‑KI‑R5及其构建方法和应用,本发明将强有力的增强子/启动子组合(CAG)通过CRISPR/Cas9基因编辑技术同源重组敲入到CD4+JurkatT细胞的CCR5基因的启动子区,基因修饰的细胞系命名为Jurkat‑KI‑R5细胞。本发明所述Jurkat‑KI‑R5细胞CAG启动子的精确重组到CCR5启动子指定位置,导致CCR5稳...