拉下实验（Pull-down）的缺点 1、两个非同一定位的蛋白可能因电荷或是强亲和力的原因造成假阳性，需用其他方法再次验证，例如Co-IP等；2、验证互作是在试管中进行的生化反应，不能够完全反映细胞内蛋白真实互作的状态；3、融合表达的GST标签，肽链较长，可能会改变原目的蛋白的原有的折叠结构。实验信息 实验过程中...
GST pull down（GST融合蛋白沉降技术）是体外检测蛋白相互作用的常用方法，可验证已知蛋白之间的互作，也可用于筛选与已知蛋白互作的未知蛋白。此方法操作方便，简单易行。一、GST pull down实验原理 GST pull down的主要原理是利用DNA重组技术将已知蛋白与GST融合，而融合蛋白通过GST与固化在载体上的GTH（谷胱甘肽）亲和...
1. 阳性对照组条带清晰无杂带,阴性对照组正常,表明CHIP实验结果可信,操作合格。2. 2%对照组条带清晰可见,表明PCR扩增引物可用于该指标的检测。3. 实验组均有目的条带,表明VEGFA基因启动子区域与转录抑制因子RUNX1和ZNF24蛋白均可发生结合。技术总结样品制备上需要优化...
GST pull down+GST IB组:表示GST pull down实验后用GST进行免疫印迹。发现三组均有条带,表明GST pull down实验体系可以正常发挥功能,也表明各组体系中含有GST相关的组分。 Input + YFP IB组:表示不经过GST pull down实验,直接对实验前各组的混合体系用YFP进行免疫印迹,是阳性对照组表明各组有YFP相关组分。 6、...
GST-Sw-5b + NSm21-YFP组有条带,表明两种物质之间存在互作,结合阴性对照组结果证明是Sw-5b 与NSm21之间存在互作。 GST pull down+GST IB组:表示GST pull down实验后用GST进行免疫印迹。发现三组均有条带,表明GST pull down实验体系可以正常发挥功能,也表明各组体系中含有GST相关的组分。 Input + YFP IB组...
实验组中加入的是GST融合蛋白,对照组是GST蛋白,实验组和对照组都加入His融合蛋白,目的是证明GST标签不会和His融合蛋白有相互作用。 Pull down 通过GSH Beads 沉淀GST蛋白或GST融合蛋白,如果GST融合蛋白能够拉下His融合蛋白,而GST不能拉下His融合蛋白,则说明A蛋白和B蛋白有相互作用 都拉下来或者都拉不下来则不能说...
GST pull-down是体外验证两种蛋白直接相互作用的研究方法,其原理是将目的蛋白与GST融合表达,固定在谷胱甘肽(GSH)亲和树脂上作为与目的蛋白亲和的载体,充当“诱饵蛋白”,捕获相互作用的“捕获蛋白”(靶蛋白),将结合物洗脱后WB分析确认两种蛋白的相互作用。
假定A蛋白和B蛋白可能有相互作用，将纯化的融合GST标签的A蛋白和纯化的B蛋白以及能特异结合GST的Sephrose4Bbeads孵育一定时间，充分洗涤未结合的蛋白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳，通过Westernblotting检测，可以看见GST-A和B分别对应的条带,表明A和B因相互作用而被GST-Apull-down；而GST对照组始终仅有一个条带。
通过Western blot检测结果,我们可以看到GST-a蛋白和b蛋白所对应的条带,即表明了a蛋白和b蛋白因发生相互作用而被GST-a pull down(GST对照只显示一个条带)。 GST pull down实验步骤 GST-a融合蛋白的制备 1.GST-a融合蛋白的表达 (1)将目的蛋白与GST的重组质粒转化到BL21菌株中;...
通过WB检测结果,可以看到GST-a蛋白和b蛋白所对应的条带,即表明a蛋白和b蛋白因发生相互作用而被GST-a pull down(GST对照只显示一个条带)。 实验流程: 实验步骤: 1. 球珠蛋白体系的制备 球珠蛋白体系的制备 1.1. 制备GST-a融合蛋白 (i)将目的蛋白与GST的重组质粒转化到BL21菌株中;...