(1) 加样:取1.5ml EP管,加入GST融合蛋白(对照组用GST蛋白) 5µg, 检测是否与GST融合蛋白结合的另一蛋白5µg,20-50µl GST琼脂糖磁珠,补充GST-Pull down buffer到总体积500µl左右。 (2) 结合:4℃结合4～8 hr或过夜,配合磁力架收集磁珠,去上清。 (3) 漂洗:加入500-1000 µl GST-Pull down...
GST-pulldown操作说明 GST Pulldown（研究GST-CDC-48与Rpn11相互作用）1、取两只1.5mL EP管，标记为实验组和对照组，并向每支管中分别加入25μL GST-beeds 20%乙醇充分混合液。2、加入Wash buffer 1 洗涤两次，每次500μL，5000rpm，4℃离心30s去除上清液。Wash buffer 配比如下：Tris-HCL 50 mM NaCL 100...
13、至此,GST pull-down的A蛋白铆定材料准备完毕。对于从事相关研究工作的实验者来说,下面的实验方案可供选择: A.将GST-A融合蛋白磁珠与经兔网织红细胞体系翻译的同位素标记的B蛋白进行结合反应1h,洗三次后加Loading buffer,煮沸1min上样电泳,真空干燥后压X-光片进行放射自显影。 B.在细菌中表达B蛋白(方法和...
PULL-03Elution Bufferforpull-down100 mL+4 °C非变性洗脱液,用于衔接下游WB及MS PULL-04TCEP250mg+4 °C 下列组分收到后需储存在室温中 IF9217QuickStain™ One-Step Protein Gel (PAGE) Blue Stain 蛋白PAGE胶快速染色液(用于显示蛋白条带及MS质谱)50mL室温超快染色蛋白胶,灵敏度极高,10分钟即可让低至...
一、GST pull-down 基本知识 GST pull-down 技术是一种在体外研究蛋白质相互作用的方法。通过将体外表达的GST融合蛋白结合到谷胱甘肽Beads上，与细胞裂解液孵育，互作蛋白将吸附在Beads上。经过洗涤后，使用特定的洗脱液将互作蛋白复合物从Beads上洗脱下来。这种方法可用于验证已知蛋白间的互作，以及鉴定与...
4.取等体积的量验证GST与GST-pin1,洗三次加2xsample buffer 跑胶考马斯亮蓝染色 至此,蛋白纯化完 2.GST-pull down 1.两盘10cm皿293T,转染靶蛋白质粒(有载体需增加一组) 2.收样如IP裂解,将蛋白裂解液加入适量凝胶中,孵育3-4h 3.蛋白凝胶
2、 GST pull-down 2.1 磁珠准备 1)将Glutathione MagBeads从4℃冰箱取出,上下颠倒混匀数次,使磁珠和溶液混合均匀,分别取30μL到2个⼲净的1.5mL Ep管中,记为对照组和实验组; 2)加⼊0.5mL预冷的Washing buffer重悬磁珠,置于磁力架上静置1min,分离磁珠和溶液,⽤移液枪小心吸弃上清; ...
GST pull-down是两种蛋白在试管内(细胞以外)发生生化反应互作的结果,只要互作蛋白间具有相互结合的结构域基础即可,验证蛋白之间直接的相互作用。 Co-IP实验是细胞内高表达目的蛋白,并通过IgG球珠-抗体-蛋白复合物体系,分离出互作的蛋白复合物,是细胞内的体内反应结合。
本实验详细介绍了GST-pull down 技术的操作流程,主要包括:GST蛋白的大量制备,谷胱甘肽-琼脂糖树脂的处理,GST蛋白的结合,细胞裂解液的预清除及细胞裂解液的探测。 实验步骤 1. 大量制备GST蛋白 1) 活化冻存菌种GST和GST-X:按1:50比例将表达蛋白的冻存菌液加入5mlLB(Amp+),37℃,140~150rpm培养过夜 ...
在GST-pulldown 实验中，添加 IgG 对照的目的是为了规避假阳性结果。GST-pulldown 实验中，我们使用 GST 标签的蛋白质作为 bait，绑定目标蛋白，并使用 beads 将其捕获。然而，GST 标签本身也可以bind 到一些蛋白质，这可能会导致假阳性结果。IgG 对照是指使用同样浓度和同样的 buffer 中的mouse IgG...